Insuliiniteknologia

Ennaltaehkäisy

Insuliini on yksi ihmisen kehon itse tuottamista hormoneista, erityisesti haima. Tämän aineen erittymisen rikkominen johtaa sellaisen vakavan sairauden syntymiseen kuin diabetes. Sen hoitoon synteettisen hormonin avulla, joka on pitkään eristetty karjan haimasta. Insuliinin tuottamiseen käytettyä tekniikkaa hyvin yleisen bakteerin - Escherichia coli tai hiivasienen - avulla on kuitenkin käytetty jo pitkään. Tämän menetelmän avulla voit välttää vieraiden proteiinien aiheuttamia allergisia reaktioita, joilla on pieni ero ihmisestä.

Teknologinen järjestelmä

Insuliinin tuotantoteknologia sisältää kaikki biotekniikan tuotteiden valmistuksen tärkeimmät vaiheet. Tuloksena on kiteinen lopputuote, jota käytetään sitten valmistamaan injektioliuoksia, joita käytetään vakavan diabetes mellituksen hoidossa tyypin I ja II tyypissä. Tämän hormonin pääasiallinen vaikutus kehossa ilmenee veren sisältämän glukoosin määrän vähenemisenä.

Insuliinin tuotannon vaiheet ovat seuraavat:

Alustavat. Se harjoittaa veden ja ilman valmistusta ja puhdistamista, teollisuustilojen puhdistusta ja laitteiden sterilointia, henkilöstön tarkastusta, käsien käsittelyä ja steriilien kenkien ja vaatteiden myöntämistä. Myös alustavassa vaiheessa valmistetaan molekyyli- ketjujen, joista proteiini on koottu, ensisijainen kemiallinen synteesi. Ketju A sisältää 21 aminohappotähdettä ja ketju B sisältää 30 aminohappoa.
Ravinteiden liuosten ja soluviljelyn valmistaminen. Elävän solun valmistamiseksi tuotetaan tarvittava yhdiste, vastaava geeni syötetään. Tätä varten plasmidi leikataan erityisillä entsyymeillä, rajoituksilla, ja tarvittavien yhdisteiden synteesiä koodaavat geenit ommellaan siihen. Sitten, käyttäen mikroinjektiomenetelmää, modifioitu plasmidi palautetaan soluun.
Solususpension viljely. Geneettisesti muunnetut solut sijoitetaan ravintoaineliuokseen, jossa on kaikki kasvuun ja lisääntymiseen ja sterilointiin tarvittavat aineet. Viljelmän viljely tapahtuu erityisissä bioreaktoreissa, joissa esikäsitelty ilma syötetään. Reaktoriin lisätään määräajoin tietty määrä ravinneliuosta ja samanaikaisesti sama solususpensiotilavuus poistetaan.
Kulttuurin jakaminen. Nesteen ja soluviljelmän erottaminen suoritetaan sedimentoimalla (sedimentaatio) erityisissä sedimentaattoreissa ja sitten suodattamalla, mikä sallii solujen eheyden säilymisen.
Aineen kromatografinen puhdistus. Se suoritetaan sopivalla laitteella käyttäen erilaisia menetelmiä, erityisesti etu-, anioninvaihto- ja geelipermeaatiokromatografiaa.
Valkuaismolekyylin saaminen. Todellisessa biotekniikan vaiheessa syntyy tuottamattoman insuliinimolekyylin synteesi. Ja sen ketjujen kaksi osaa. Ne on ommeltu saatujen ketjujen hapettumisen ja taittamisen jälkeen, jolloin muodostuu disulfidisiltoja.
Pakastekuivatus erityisessä uunissa, jonka jälkeen tuloksena oleva kiteinen valmiste tarkistetaan standardin mukaiseksi, pakataan, leimataan ja kuljetetaan kuluttajalle.

Yrityksemme tarjoaa suotuisilla ehdoilla valmiita tuotantolinjoja, joissa kaikki insuliinintuotantoteknologia on täysin noudatettu. Tarkkojen laskelmien, teknisen ja tietoturvan sekä henkilöstön koulutuksen ansiosta kattavan ohjelman puitteissa yhtiö on kannattavaa ja sen tuotteet ovat kysynnässä.

Insuliinin tyypit ja sen valmistusmenetelmät

1. Insuliinin tyypit

2. Insuliinin saaminen

Insuliini (latinalaiselta Insula-saarelta) on peptidihormoni, joka muodostuu Langerhansin haiman saarekkeiden beetasoluista. Se vaikuttaa monipuolisesti metaboliaan lähes kaikissa kudoksissa.

Insuliinin pääasiallisena tehtävänä on varmistaa solukalvojen läpäisevyys glukoosimolekyyleille. Yksinkertaistetussa muodossa voimme sanoa, että hiilihydraatit, mutta myös kaikki ravintoaineet jaetaan lopulta glukoosiin, jota käytetään syntetisoimaan muita hiilipitoisia molekyylejä, ja se on ainoa polttoainemuoto solujen voimalaitoksille - mitokondriot. Ilman insuliinia solukalvon läpäisevyys glukoosiin laskee 20-kertaiseksi, ja solut kuolevat nälkään, ja veren liuennut ylimääräinen sokeri myrkyttää kehoa.

Beetasolujen tuhoutumisesta johtuva insuliinierityksen heikentyminen - absoluuttinen insuliinipuutos - on keskeinen tekijä tyypin 1 diabeteksen patogeneesissä. Insuliinin vaikutuksen rikkoutuminen kudokseen - suhteellinen insuliinipuutos - on tärkeä paikka tyypin 2 diabeteksen kehittymisessä.

Insuliinin löytämisen historia liittyy venäläisen lääkäri I.M. Sobolev (1800-luvun toinen puoli), joka osoitti, että sokeripitoisuutta ihmisveressä säätelee haiman erityinen hormoni.

Vuonna 1922 eläimen haimasta eristettyä insuliinia esiteltiin ensin kymmenen vuoden ikäiselle diabeettiselle pojalle. tulos ylitti kaikki odotukset, ja vuosi myöhemmin amerikkalainen yritys Eli Lilly julkaisi ensimmäisen eläininsuliinivalmisteen.

Saatuaan ensimmäisen teollisuuserän insuliinia lähivuosina valtava tapa eristää ja puhdistaa. Tämän seurauksena hormoni oli saatavilla potilaille, joilla on tyypin 1 diabetes.

Vuonna 1935 Tanskan tutkija Hagedorn optimoi insuliinin toiminnan kehossa ehdottamalla pitkäaikaisia lääkkeitä.

Ensimmäiset insuliinikiteet saatiin vuonna 1952, ja vuonna 1954 englantilainen biokemisti G.Senger selvitti insuliinin rakenteen. Menetelmien kehittäminen hormonin puhdistamiseksi muista hormonaalisista aineista ja insuliinin hajoamistuotteista mahdollisti homogeenisen insuliinin saamisen, jota kutsutaan yksikomponenttiseksi insuliiniksi.

70-luvun alussa gg. Neuvostoliiton tutkijat A. Yudaev ja S. Shvachkin ehdottivat insuliinin kemiallista synteesiä, mutta tämän synteesin toteuttaminen teollisessa mittakaavassa oli kallista ja kannattamatonta.

Tulevaisuudessa insuliinien puhdistusaste parani asteittain, mikä heikensi insuliinialergioiden, munuaisten vajaatoiminnan, näköhäiriöiden ja immuuninsuliiniresistenssin aiheuttamia ongelmia. Tehokkain hormoni oli tarpeen diabetes mellituksen korvaushoidolle - homologiselle insuliinille eli ihmisinsuliinille.

80-luvulla molekyylibiologian edistyminen mahdollisti sekä ihmisen insuliiniketjujen syntetisoinnin käyttäen E. colia, jotka sitten yhdistettiin biologisesti aktiiviseen hormonimolekyyliin, ja rekombinantti-insuliini saatiin Venäjän tiedeakatemian bioorgaanisen kemian instituutissa käyttäen E.coli-geneettisesti muokattuja kantoja.

Affiniteettikromatografian käyttö vähensi merkittävästi valmisteessa olevien kontaminoivien proteiinien pitoisuutta, jolla oli suurempi molekyylipaino kuin insuliinilla. Tällaisia proteiineja ovat proinsuliini ja osittain pilkotut proinsuliinit, jotka kykenevät indusoimaan antiinsuliinivasta-aineiden tuotannon.

Ihmisen insuliinin käyttö hoidon alusta minimoi allergisten reaktioiden esiintymisen. Ihmisen insuliini imeytyy nopeammin ja lääkkeen muodosta riippumatta on lyhyempi vaikutusaika kuin eläininsuliinilla. Ihmisen insuliinit ovat vähemmän immunogeenejä kuin sianliha, erityisesti naudan ja sian insuliinien sekoitus.

1. Insuliinin tyypit

Insuliinivalmisteet eroavat puhdistusasteessa; vastaanottolähde (nauta, sika, ihminen); insuliiniliuokseen lisätyt aineet (sen vaikutuksen pidentäminen, bakteriostaatit jne.); konsentraatio; pH-arvo; mahdollisuus sekoittaa ICD ja SDI.

Insuliinivalmisteet vaihtelevat lähteen mukaan. Sika ja naudan insuliini eroavat ihmisen aminohappokoostumuksessa: nautaeläimet kolmessa aminohapossa ja sika yhdessä. Ei ole yllättävää, että naudan insuliinihoidossa haittavaikutukset kehittyvät paljon useammin kuin sian tai ihmisinsuliinin hoidossa. Nämä reaktiot ilmaistaan immunologisessa insuliiniresistenssissä, insuliinialergiassa, lipodystrofiassa (ihonalaisen rasvan muutos pistoskohdassa).

Huolimatta naudan insuliinin ilmeisistä haitoista sitä käytetään edelleen laajalti maailmassa. Ja vielä, immunologisesti, nautaeläinten insuliinin puutteet ovat ilmeisiä: missään tapauksessa ei ole suositeltavaa määrätä sitä potilaille, joilla on äskettäin diagnosoitu diabetes, raskaana olevat naiset tai lyhytaikainen insuliinihoito, esimerkiksi perioperatiivisessa jaksossa. Naudan insuliinin negatiivisia ominaisuuksia säilytetään myös silloin, kun niitä käytetään seoksessa sian kanssa, joten sekoitettuja (sian + nautaeläimiä) insuliineja ei myöskään saa käyttää näiden ryhmien hoitoon.

Ihmisen insuliinivalmisteet kemiallista rakennetta varten ovat täysin identtisiä ihmisen insuliinin kanssa.

Biosynteettisen menetelmän pääasiallinen ongelma ihmisen insuliinin saamiseksi on lopputuotteen täydellinen puhdistus käytettyjen mikro-organismien pienimmistä epäpuhtauksista ja niiden aineenvaihduntatuotteista. Uudet laadunvalvontamenetelmät varmistavat, että edellä mainittujen valmistajien ihmisen biosynteettiset insuliinit eivät sisällä haitallisia epäpuhtauksia; siten niiden puhdistusaste ja glukoosin alentava tehokkuus täyttävät korkeimmat vaatimukset ja ovat lähes samat. Mitään ei-toivottuja sivuvaikutuksia, epäpuhtauksista riippuen, näillä lääkkeillä ei ole insuliinia.

Tällä hetkellä lääketieteessä käytetään kolmea erilaista insuliinia:

- lyhyen kantaman, jonka vaikutus alkaa nopeasti;

- toiminnan keskimääräinen kesto;

- pitkäkestoinen ja hidas vaikutus.

Taulukko 1. Kaupallisten insuliinivalmisteiden ominaisuudet

Lyhytvaikutteinen insuliini (ICD) - tavallinen insuliini - on lyhytvaikutteinen kiteinen sinkki-insuliini, joka liukenee neutraaliin pH-arvoon, jonka vaikutus kehittyy 15 minuutin kuluessa ihonalaisesta antamisesta ja kestää 5-7 tuntia.

Ensimmäinen pitkäaikainen insuliini (SDI) luotiin 30-luvun lopulla, jotta potilaat voisivat tehdä injektioita harvemmin kuin yksinään käytettäessä, jos mahdollista kerran päivässä. Toiminnan keston lisäämiseksi kaikki muut insuliinivalmisteet modifioidaan ja, kun ne liuotetaan neutraaliin väliaineeseen, muodostavat suspension. Ne sisältävät protamiinia fosfaattipuskurissa - protamiinisinkki-insuliini ja NPH (neutraali protamiini Hagedorn) - NPH-insuliini tai erilaiset sinkin pitoisuudet asetaattipuskurissa - insuliini ultralente, teippi, seitsemäsosa.

Keskipitkän aikavälin insuliinivalmisteet sisältävät protamiinia, joka on keskimäärin m. Proteiini. 4400, runsaasti arginiinia ja johdettu kirjolohi. Kompleksin muodostamiseksi tarvitaan protamiinin ja insuliinin 1:10 suhde. ihonalaisen antamisen jälkeen proteolyyttiset entsyymit tuhoavat protamiinin, jolloin insuliini imeytyy.

NPH-insuliini ei muuta sen kanssa sekoitetun säätelyinsuliinin farmakokineettistä profiilia. NPH-insuliini on parempi kuin insuliininauha osana tavallista insuliinia sisältävien terapeuttisten seosten keskimääräistä vaikutuksen kestoa.

Fosfaattipuskurissa kaikki insuliinit muodostavat helposti kiteitä sinkillä, mutta vain naudan insuliinikiteet ovat riittävän hydrofobisia, jotta saadaan aikaan ultralentille ominainen hitaasti ja tasaisesti vapautuva insuliinin vapautuminen. Sinkkinsuliinin sinkkikristallit liukenevat nopeammin, vaikutus tulee aikaisemmin, vaikutuksen kesto on lyhyempi. Siksi ei ole lääkettä, joka sisältää vain sian insuliinia. Monokomponenttia sian insuliinia tuotetaan nimellä insuliinisuspensio, insuliinin neutraali, insuliinisofaani, insuliini-amino- amidi.

Insuliininauha on seos, jossa on puoliliuoksen insuliinia (amorfinen insuliinisakka ja sinkki-ionit asetaattipuskurissa, jonka vaikutus haihtuu suhteellisen nopeasti) 70%: lla insuliinia ultralente (huonosti liukeneva kiteinen sinkki-insuliini, jolla on viivästynyt puhkeaminen ja pitkäaikainen vaikutus). Nämä kaksi komponenttia tarjoavat yhdistelmän, jolla on suhteellisen nopea imeytyminen ja stabiili pitkäaikainen vaikutus, mikä tekee insuliininauhasta sopivan terapeuttisen aineen.

2. Insuliinin saaminen

Ihmisen insuliinia voidaan valmistaa neljällä tavalla:

1) täydellinen kemiallinen synteesi;

2) uuttaminen ihmisen haimasta (molemmat menetelmät eivät sovellu tehottomuuden vuoksi: ensimmäisen menetelmän riittämätön kehitys ja massatuotannon raaka-aineiden puuttuminen toisella menetelmällä);

3) puolisynteettisellä menetelmällä käyttäen entsyymikemiallista substituutiota sianinsuliinin aminohapon alaniinin B-ketjun asemassa 30 treoniinin kanssa;

4) biosynteettinen menetelmä geenitekniikan tekniikalle. Kaksi viimeistä menetelmää mahdollistavat korkean puhtauden omaavan ihmisinsuliinin saamisen.

Tällä hetkellä ihmisen insuliinia saadaan pääasiassa kahdella tavalla: modifioimalla sian insuliinia synteettisellä entsymaattisella menetelmällä ja geenitekniikan menetelmällä.

Insuliini oli ensimmäinen proteiini, joka saatiin kaupallisiin tarkoituksiin käyttäen rekombinantti-DNA-tekniikkaa. Geneettisesti muokatun ihmisen insuliinin saamiseksi on kaksi pääasiallista lähestymistapaa.

Ensimmäisessä tapauksessa erilliset (eri tuottajakannat) tuottavat molempia ketjuja, joita seuraa molekyylin taittuminen (disulfidisiltojen muodostuminen) ja isomuotojen erottaminen.

Toisessa valmistuksessa esiasteen (proinsuliini) muodossa, jota seuraa entsymaattinen halkaisu trypsiinin ja karboksipeptidaasi B: n kanssa hormonin aktiiviseen muotoon. Tällä hetkellä edullisin on saada insuliini esiasteeksi, joka varmistaa disulfidisillojen oikean sulkemisen (ketjujen erillisen tuotannon tapauksessa suoritetaan peräkkäiset denaturointisyklit, isoformin erottaminen ja renaturaatio).

Molemmissa lähestymistavoissa on mahdollista saada sekä lähtöaineet (A- että B-ketjut tai proinsuliini) sekä osana hybridiproteiineja. A- ja B-ketjujen tai proinsuliinin lisäksi voi esiintyä hybridiproteiinien koostumusta:

- proteiinikantaja, joka tarjoaa hybridiproteiinin kuljetuksen solun tai viljelyalustan periplasmiseen tilaan;

- affiniteettikomponentti, joka helpottaa suuresti hybridiproteiinin valintaa.

Samalla molemmat näistä komponenteista voivat olla samanaikaisesti hybridiproteiinin koostumuksessa. Lisäksi, kun luodaan hybridiproteiineja, voidaan käyttää moniulotteisuuden periaatetta (toisin sanoen hybridiproteiinissa on useita kopioita kohdepolypeptidistä), mikä tekee mahdolliseksi kohde- tuotteen saannon huomattavan kasvun.

Isossa-Britanniassa molemmat ihmisen insuliiniketjut syntetisoitiin käyttäen E. colia, jotka sitten liitettiin biologisesti aktiiviseen hormonimolekyyliin. Jotta yksisoluinen organismi syntetisoi insuliinimolekyylejä ribosomeihinsa, on välttämätöntä toimittaa sille tarvittava ohjelma, eli hormonin geenin tuominen siihen.

Kemiallisesti saadaan insuliinin tai kahden geenin geeniohjelman biosynteesi-prekursori, ohjelmoimalla erikseen insuliiniketjujen A ja B biosynteesi.

Seuraava vaihe on insuliiniprekursorin (tai ketjun geenien erikseen) geenin sisällyttäminen E. colin genomiin, joka on erityinen E. coli -kanta, jota kasvatetaan laboratorio-olosuhteissa. Tämä tehtävä suoritetaan geenitekniikalla.

Plasmidi eristetään E. colista vastaavalla restriktioentsyymillä. Synteettinen geeni insertoidaan plasmidiin (kloonataan P-galaktosidaasi E. coli -funktionaalisesti aktiivisen C-terminaalisen osan kanssa). Tämän seurauksena E. coli kykenee syntetisoimaan proteiiniketjua, joka koostuu galaktosidaasista ja insuliinista. Syntetisoidut polypeptidit pilkotaan kemiallisesti entsyymistä ja puhdistetaan sitten. Bakteereissa syntetisoidaan noin 100 000 insuliinimolekyyliä bakteerisolua kohti.

E. colin tuottaman hormoniaineen luonne määritetään, millä geenillä insertoidaan yksisoluisen organismin genomiin. Jos insuliiniprekursorigeeni kloonataan, bakteeri syntetisoi insuliiniprekursorin, joka sitten altistetaan restriktioentsyymikäsittelylle, jotta poistetaan preperiteetti C-peptidin eristämisellä, mikä johtaa biologisesti aktiiviseen insuliiniin.

Puhdistetun ihmisen insuliinin saamiseksi biomassasta eristetty hybridiproteiini altistetaan kemialliselle entsymaattiselle transformaatiolle ja vastaavalle kromatografiselle puhdistukselle (primaarinen, geeliä läpäisevä, anioninvaihto).

Rekombinantti-insuliini saatiin RAS-instituutissa käyttäen geneettisesti muokattuja E.coli-kantoja. Esiaste, hybridiproteiini, joka on ilmaistu 40%: n koko solun proteiinista, joka sisältää preproinsuliinia, vapautuu kasvatetusta biomassasta. Sen muuntaminen insuliiniksi in vitro tapahtuu samalla sekvenssillä kuin in vivo - johtava polypeptidi pilkotaan, preproinsuliini muunnetaan insuliiniksi hapettavien sulfitolyysivaiheiden jälkeen, mitä seuraa kolmen disulfidisidoksen pelkistävä sulkeminen ja C-peptidin sitoutumisen entsymaattinen eristäminen. Kromatografisten puhdistus- sarjojen, mukaan lukien ioninvaihto, geeli ja HPLC, jälkeen saadaan suuri puhtaus ja luonnollinen aktiivisuus.

Voidaan käyttää kantaa, jossa on plasmidi-upotettu nukleotidisekvenssi, joka ilmentää fuusioproteiinia, joka koostuu lineaarisesta proinsuliinista ja Staphylococcus aureus -proteiinifragmentista, joka on liitetty sen N-päähän.

Rekombinanttikannan solujen tyydyttyneen biomassan viljely takaa hybridiproteiinin tuotannon alkamisen, jonka eristäminen ja peräkkäinen transformaatio putkessa johtaa insuliiniin.

Toinen tapa on myös mahdollinen: bakteerien ilmentämisjärjestelmässä ilmenee fuusio-rekombinanttiproteiini, joka koostuu ihmisen proinsuliinista ja polyhistidiinihän, joka on kiinnitetty siihen metioniinitähteen kautta. Se eristetään käyttäen kelaattikromatografiaa inkluusiokappaleista peräisin olevilla Ni-agaroosipylväillä ja pilkotaan syanogeenibromidilla.

Eristetty proteiini on S-sulfonoitu. Saadun proinsuliinin kartoitus- ja massaspektrometrinen analyysi, joka puhdistettiin ioninvaihtokromatografialla anioninvaihtimella ja RP (käänteisfaasi) HPLC: llä (korkean suorituskyvyn nestekromatografia), osoittavat, että disulfidisillat vastaavat natiivin ihmisen proinsuliinin disulfidisiltoja.

Äskettäin on kiinnitetty erityistä huomiota yksinkertaistamaan menetelmää rekombinantti-insuliinin tuottamiseksi geenitekniikan menetelmillä. Esimerkiksi on mahdollista saada fuusioproteiini, joka koostuu interleukiinin 2 johtopeptidistä, joka on kiinnitetty proinsuliinin N-päähän lysiinitähteen kautta. Proteiini ilmentyy tehokkaasti ja lokalisoituu inkluusiokappaleisiin. Eristämisen jälkeen proteiini pilkotaan trypsiinillä insuliinin ja C-peptidin tuottamiseksi.

Saatu insuliini ja C-peptidi puhdistettiin RP-HPLC: llä. Kun muodostetaan fuusiorakenteita, kantajaproteiinin ja kohdepolypeptidin massasuhde on hyvin merkittävä. C-peptidit yhdistetään päähän -periaatteella käyttäen aminohappo-välikappaleita, joissa on Sfi I-restriktiokohta ja kaksi arginiinitähteitä välikappaleen alussa ja lopussa sen jälkeen, kun proteiini on pilkottu trypsiinillä. HPLC-katkaisutuotteet osoittavat, että C-peptidin pilkkominen on kvantitatiivinen ja tämä mahdollistaa multimeeristen synteettisten geenien menetelmän käyttämisen kohdepolypeptidien saamiseksi teollisessa mittakaavassa.

Diabetes mellitus on krooninen sairaus, jonka aiheuttaa absoluuttinen tai suhteellinen insuliinipuutos. Sille on tunnusomaista hiilihydraattien syvä metabolinen häiriö, jossa on hyperglykemia ja glukosuria, sekä muut aineenvaihdunnan häiriöt, jotka johtuvat useista geneettisistä ja ulkoisista tekijöistä.

Tähän saakka oleva insuliini toimii radikaalina ja useimmissa tapauksissa ainoa tapa ylläpitää diabeetikkojen ihmisten elämää ja vammaa. Ennen insuliinin saamista ja käyttöönottoa klinikalle 1922-1923. Potilaat, joilla on diabetes mellitus tyyppi I, odottivat tappavaa tulosta yhdestä kahteen vuoteen sairauden alkamisesta huolimatta kaikkein heikentävimmistä ruokavalioista. Potilailla, joilla on diabetes, tarvitsen elinikäistä korvaushoitoa insuliinin kanssa. Insuliinin säännöllisen käyttöönoton eri syistä johtuva päättyminen johtaa komplikaatioiden nopeaan kehittymiseen ja potilaan välittömään kuolemaan.

Tällä hetkellä diabeteksen esiintyvyys on kolmannessa paikassa sydän- ja verisuonitautien ja onkologisten sairauksien jälkeen. Maailman terveysjärjestön mukaan diabeteksen esiintyvyys aikuisväestön keskuudessa useimmilla maailman alueilla on 2-5% ja on taipumus lisätä potilaiden määrää lähes kaksi kertaa 15 vuoden välein. Terveydenhuollon alalla tapahtuneesta selvästä edistymisestä huolimatta insuliiniriippuvaissa potilaiden määrä kasvaa joka vuosi ja tällä hetkellä Venäjällä vain noin 2 miljoonaa ihmistä.

Kotimaisen geneettisen insuliinin lääkkeiden luominen avaa uusia mahdollisuuksia ratkaista monia diabetologian ongelmia Venäjällä miljoonien diabeetikkojen ihmisten elämää pelastamaan.

Biotekniikka: Lukioille tarkoitettu oppikirja / Ed. NS Egorova, V.D. Samuilova.- M.: Korkeakoulu, 1987, s. 15-25.

Geenitekniikka ihmisen insuliini. Kromatografisen erottamisen tehokkuuden parantaminen käyttämällä bifunktionaalisuutta. / Romanchikov, A.B., Yakimov, S. A., Klyushnichenko, V.E., Arutunyan, A.M., Vulfson, A.N. // Bioorganic Chemistry, 1997 - 23, nro 2

Glick B., Pasternak J. Molecular biotechnology. Periaatteet ja soveltaminen. M: Mir, 2002.

Egorov N. S., Samuilov V. D. Nykyaikaiset menetelmät mikro-organismien teollisten kantojen luomiseksi // Biotekniikka. Vol. 2. M.: Korkeakoulu, 1988. 208 s.

Trypsiinin ja karboksipeptidaasi B: n immobilisointi modifioidulle piidioksidille ja niiden käyttö rekombinantin ihmisen proinsuliinin muuttamiseksi insuliiniksi. / Kudryavtseva N. E., Zhigis L.S., Zubov V.P., Vulfson A.I, Maltsev K.V., Rumsh L.D. // Kemialliset lääkkeet. J., 1995 - 29, nro 1, s. 61 - 64.

Molekyylibiologia. Proteiinien rakenne ja toiminta / Stepanov V. M. / / Moskova, lukio, 1996.

Farmaseuttisen bioteknologian perusteet: opinto-opas / ETC. Prishchep, V.S. Chuchalin, K.L. Zaikov, L.K. Mikhalev. - Rostov-on-Don: Phoenix; Tomsk: Kustantaja NTL, 2006.

Insuliinifragmenttien synteesi ja niiden fysikaalis-kemiallisten ja immunologisten ominaisuuksien tutkimus. / Panin L. E., Tuzikov F. V., Poteryaeva ON, Maksyutov A.Z., Tuzikova N.A., Sabirov A.N. // Bioorganic Chemistry, 1997–23, nro 12, s. 953–960.

Insuliinigeneettisesti muunnetun menetelmän tuotantoa koskevat säännöt

Etusivu> Esittely> Lääketiede, terveys

Valtion oppilaitos

korkea-asteen ammatillinen koulutus

Kurskin lääketieteellinen yliopisto

Liittovaltion terveys- ja sosiaalikehitysvirasto

Farmaseuttisen teknologian laitos

saada geneettisesti muunnettua insuliinia käyttäen rDNA-bioteknologiaa

Viides vuosi opiskelija 5 ryhmää

FT, vanhempi opettaja Maravina I.N.

I jakso. Lopputuotteen ominaisuudet 3

II jakso. Raaka-aineiden ominaisuudet 5

III jakso. Kemiallisen tuotannon järjestelmä 6

IV jakso. Tuotantoteknologia 7

V jakso. Tuotantovirtauskaavio ja erittely

VI jakso. Prosessin lausunto 10

VII jakso. Analyysimenetelmät 14

VIII jakso. Turvallisuus, paloturvallisuus,

teollisuuden puhtaanapito 16

IX jakso. Luettelo valmistusohjeista 17

Luku I. Lopputuotteen ominaisuudet

Kuiva insuliinibiomassa

Kuvaus. Insuliiniliuokset ovat kirkkaita, värittömiä tai hieman kellertäviä happamia nesteitä (pH 2,0–3,5), joka valmistetaan laimentamalla kiteistä insuliinia vetykloridihapolla happamaksi ja lisäämällä glyserolia ja 0,25–0,30% fenolia tai trikresolia. säilytykseen.

Hypoglykeeminen aine, lyhytvaikutteinen insuliini. Muodostaa vuorovaikutuksen solun ulkoisen kalvon spesifisen reseptorin kanssa ja muodostaa insuliinireseptorikompleksin. Insuliinireseptorikompleksi stimuloi solunsisäisiä prosesseja, kun cAMP-biosynteesi aktivoituu rasvasoluissa ja maksa- soluissa tai tunkeutuu suoraan lihassoluihin. useiden keskeisten entsyymien (heksokinaasi, pyruvaattikinaasi, glykogeenisyntetaasi jne.) synteesi. Verensokerin lasku johtuu sen solunsisäisen kuljetuksen lisääntymisestä, lisääntyneestä kudosten imeytymisestä ja imeytymisestä, lipogeneesin stimuloinnista, glykogenogeneesistä, proteiinisynteesistä, maksan glukoosintuotannon vähenemisestä jne. tekijät (annoksesta, menetelmästä ja injektiokohdasta). Vaikutusajankohdan jälkeen - 0,5 tunnin jälkeen - maksimivaikutus - 1-3 tunnin kuluttua, vaikutuksen kesto - 8 tuntia.

Tyypin 1 diabetes (insuliiniriippuvainen). Tyypin 2 diabetes (ei-insuliiniriippuvainen): oraalisten hypoglykeemisten aineiden resistenssivaihe, osittainen resistenssi näille lääkkeille (yhdistelmähoidon aikana), välitaudit, raskaus.

Hoidon alussa - näköhäiriö, raajojen turvotus. Liian suurten insuliiniannosten käyttöönotto tai ruokavalion rikkominen (aterioiden ohittaminen) sekä liiallinen liikunta, hypoglykemia (kylmä hiki, vaalea iho, hermostuneisuus, vapina, ahdistuneisuus, liiallinen väsymys tai heikkous, disorientaatio, huimaus, päänsärky, voimakas nälän tunne, tilapäinen näkövamma, pahoinvointi, takykardia, vakavissa tapauksissa - tajunnan menetys, kooma). Systeemiset allergiset reaktiot: lisääntynyt hikoilu, oksentelu, hengitysvaikeudet, sydämentykytys, huimaus.

Kestoaika - 1 vuosi valmistuspäivästä.

II jakso. Raaka-aineiden ominaisuudet

Ketjujen A ja B synteesiä koodaavien geenien ketjut

Kemiallisesti syntetisoitu

Kulttuurin on oltava puhdasta

Nelikerroksiset paperipussit

Kankaat puuvillaa

III jakso. Kemiallisen tuotannon järjestelmä

Geneettisesti muunnetun insuliinin tuotannossa ei ole kemiallisia muutoksia.

IV jakso Insuliinin tuotannon tekninen järjestelmä

Tilojen ja laitteiden valmistelu

Saniteettituotannon tuotanto

Teknisten vaatteiden valmistelu

Ketjujen A ja B synteesi

Geenien tuonti plasmidiin

R-DNA: n lisääminen sallivaan soluun

Ravinteiden valmistus

Viljelysuspensioviljelmä

Insuliinimolekyylin saaminen

FS-indikaattoreiden mukaan

Instrumentaalinen tuotantojärjestelmä ja laitteiden erittely

1 - Kemiallinen reaktori

2 - Geenien lisääminen plasmidiin

4 - Jatkuva sterilointiyksikkö

5 - Teollisuusbioreaktori

6 - Ketjujen valinta

7 - Kromatografinen asennus

8 - insuliinimolekyylin saaminen

9 - Pakastekuivain

10 - Analyyttinen taulukko

VI jakso. Prosessin kuvaus

BP 1. Veden valmistelu

Kalvojen tislaajat on suunniteltu saamaan suolan poistettua vettä, joka täyttää GOST 6709-97 "Tislattu vesi" -vaatimukset. Tislaajien tuottavuus - 3 - 15 l / tunti (laboratoriolaitokset taloudellisessa kokonaisuudessa) sekä 5-30 l / h (laboratoriolaitokset). Suodatusprosessi sisältää seuraavat vaiheet: aktiivihiilen esikäsittely, membraanisuodatus ja veden deionisointi ioninvaihtohartseilla. Esisuodatin poistaa tulevat vesijohtovedet suspendoidut hiukkaset, kloori, suurimolekyyliset orgaaniset aineet ja raskasmetalli-ionit. Kalvosuodatus perustuu käänteisosmoosin ilmiöön, jossa vesi, kun se kulkee puoliläpäisevän kalvon läpi, puhdistetaan siinä liuotetuista suoloista, pienimolekyylipainoisista orgaanisista epäpuhtauksista sekä bakteereista ja mikro-organismeista. Suodattimessa ioninvaihtohartsien kanssa suodos puhdistetaan kokonaan liuenneista suoloista.

BP 2. Tuotannon terveyskäsittely.

BP 2.1. Seuraavat vaatimukset asetetaan tiloihin steriilien annostusmuotojen valmistamiseksi:

Säilytettävä moitteettomassa puhtaudessa, pakollisena päivittäisenä sekä yleisenä siivous- ja määräaikaishuoltoina;

Voi altistua UV-säteilylle ilman desinfiointia varten kiinteillä tai kannettavilla säteilijöillä;

On oltava valaistus, lämpötila, kosteus ja ilmanvaihto, joilla ei ole suoraa tai epäsuoraa kielteistä vaikutusta lopputuotteiden laatuun;

Sisältää tuotantoprosessin suorittamiseen tarvittavan vähimmäismäärän laitteiden ja kalusteiden määrän;

Seinien, lattian ja katon välisen liitoksen on oltava pyöristetty;

I ja II puhtausluokkien tiloissa ei saa olla avointa viestintää, ilmakanavia;

Korkeamman puhtausasteen huoneet tulisi sijoittaa huoneeseen, jossa on alhaisempi puhtausaste. Henkilöstön ja raaka-aineiden pääsy puhtaaseen huoneeseen toteutetaan vain ilman yhdyskäytävien kautta, jotka on varustettu steriilillä ilmalla "ylhäältä alas" -järjestelmän mukaisesti;

Lopputuotteen siirto on suoritettava käyttäen kuljettimella, joka kulkee seinien läpi.

BP 2.2. Laitteiden valmistelu

Laitteiden valmistelua koskevat vaatimukset:

Laitteet on suunniteltava ja sijoitettava siten, että sen käyttö, huolto ja korjaukset voidaan suorittaa "puhtaiden" tilojen ulkopuolella;

Aseptisissa olosuhteissa käytettävien laitteiden on oltava tallennuslaitteita prosessin parametrien seurantaan ja hälytyslaitteiden esiintymiseen sen toimintahäiriön varalta;

Laitteet on puhdistettava, desinfioitava ja tarvittaessa steriloitava;

Laitetta on seurattava mikrobiologisen puhtauden suhteen;

Laitteen työpinnan tulee olla sileä, myrkytön ja ei-syövyttävä materiaali.

BP 2.3. Henkilöstön koulutus

Vaatimukset henkilöstölle:

Henkilöstöllä on oltava tietyt hygienia-, sanitaatio- ja GMP-säännöt.

Tartuntatauteja, ihon avoimia haavoja ja patogeenisen mikroflooran kantajia ei saa työskennellä;

On kiellettyä puhua, syödä ruokaa, liikkua nopeasti työpaikalla;

Noudata tarkasti henkilökohtaista hygieniaa, poista kosmetiikka kasvoista ja poista korut ennen "puhdas" huoneeseen pääsyä.

Ota suihku, pese ja puhdista kädet desinfiointiaineilla, laita joukko steriilejä teknisiä vaatteita ja kenkiä.

BP 3. Ketjujen A ja B synteesi

Ketjujen synteesi suoritetaan kemiallisella menetelmällä. Ketju A sisältää 21 aminohappotähdettä, Chain B - 30 tähteet

BP 4. Geenien lisääminen plasmidiin.

Jotta plasmidi voisi hyväksyä vieras geenin, sen ketju leikataan restriktioentsyymeillä. Ketjujen A ja B synteesiä koodaavien geenien yhdistämiseksi käytetään eri pituisia oligosakkariditähteitä - linkkereitä ja sovittimia. Kun molekyyli on suljettu, voit syöttää sen sallivaan soluun.

BP 5. R-DNA: n vieminen sallivaan soluun.

P = DNA: n vieminen E.coli-soluun suoritetaan mikroinjektiolla: plasmidia sisältävää vektori-DNA: ta injektoidaan E.coli-soluun erityisellä ultrathin-lasiadapterilla.

TP 6. Ravintoalustan valmistus

E.coli-viljelyn tärkein ravintoaine on Millerin mukaan liemi. Ainesosat: kaseiinihydrolysaatti, hiivauute, natriumkloridi, agar-agar. Lopullinen pH-arvo (25 ° C: ssa) on 7,0 ± 0,2, myös Hottingerin liemiä käytetään. Ainesosat: Hottinger-hydrolysaatti, natriumkloridi, tislattu vesi.

Ravintoalustan sterilointi suoritetaan koneessa jatkuvaa sterilointia varten - ONS. Ravintoalusta kulkee peräkkäin lämmitysosan, pito-osan ja jäähdytysosan läpi.

TP 7. Suspensioviljelmän viljely

Biokulttuurin viljely suoritetaan bioreaktoreissa, jossa suspensioviljely on sekoitettu johtuen ilman syöttämisestä bioreaktoriin. Prosessi suoritetaan puolijaksoi- sessa tilassa, kun tietty määrä tuoretta ravintoalustaa lisätään jatkuvasti bioreatoriin ja samalla otetaan sama määrä solususpensiota.

TP 8. Kudosviljelyn eristäminen.

Kudosviljelyn erottaminen ravintoalustasta suoritetaan sedimentaatiomenetelmällä (sedimentaatio) sedimentaattoreissa, syvempi erotus aikaansaadaan suodattamalla lempeä menetelmä viljelmäsolujen eheyden säilyttämiseksi.

Insuliini puhdistetaan kromatografiamenetelmillä: etu-, geeliä läpäisevä, anioninvaihto. Insuliinin ja sen johdannaisten puhdistamista sorbentteihin, joilla on voimakkaat kationinvaihtoa koskevat ominaisuudet (esimerkiksi SP-Sepharose FF), voidaan käyttää ammoniumasetaattiin perustuviin puskurijärjestelmiin, joiden ureapitoisuus on alhainen (enintään 2 M).

TP 10. Insuliinimolekyylin saaminen

Valitut ja puhdistetut ketjut taitetaan ja hapetetaan, mikä takaa sopivien disulfidisiltojen muodostumisen.

Tuotteen kuivaus suoritetaan pakastekuivaimessa.

TP 12. Valmistuotteen laadun arviointi.

Ulkonäkö (kuvatulla tavalla), aktiivisuus (biologinen menetelmä).

UMO 13. Pakkaus, merkintä, lähetys.

Insuliiniaktiivisuus mitataan toimintayksiköissä (ED) tai kansainvälisissä toimintayksiköissä (IU - Venäjä tai IU - englanti tai UI - ranska). 1 yksikkö vastaa 1/24 mg: n (41,66 μg) kiteisen insuliinin aktiivisuutta.

Vuonna 1922 Frederick Banting ehdotti, että insuliinitoimintayksikköä pidettäisiin haiman uutteen kuutiosenttimetreinä, joka toi 2-4 tunnin kuluessa terveen kani hypoglykemiaan, jonka SC-taso oli 2,5 mmol / L. Hieman myöhemmin samana vuonna sama ryhmä ehdotti "hiiren" yksikköä - insuliinimäärää, jota tarvitaan, jotta puolet kokeellisesta hiiriryhmästä saataisiin kouristuksiin (tutkijat alun perin toimivat analogisesti LD50: n kanssa).

Seuraavana vuonna kansainvälinen standardointikomitea hyväksyi insuliinitoimintayksikön määritelmän: "Veren glukoositason alentamiseksi tarvittava insuliinimäärää tasolle, jolla kohtaukset alkavat 2 kg painavilla kanilla, joita ei ole syötetty 24 tuntia." Tämä yksikkö, Bantingin ja Bestin Toronton ryhmän kunniaksi, nimettiin Toronton insuliinitoiminnoksi.

Vuonna 1925 otettiin käyttöön ensimmäinen kansainvälinen standardi, jossa todettiin, että yksi insuliinitoimintayksikkö on määrä, joka vastaa 1/8 mg kiteistä insuliinia.

Koska insuliinipuhdistuksessa on tapahtunut suurta edistystä ja tällaisen suuren yksikön käyttäminen 1936, kansakuntien liitto hyväksyi uuden kansainvälisen standardin insuliinitoiminnalle, joka yhtyi yksikköön 1/22 mg: aan kiteistä insuliinia. Vuonna 1952 standardi muutettiin uudelleen ja 1 yksikkö rinnastettiin 1 / 24,5 mg: aan kiteistä insuliinia, ja vuonna 1958 lopulta ilmestyi neljäs standardi (1 U on 1/24 mg kiteistä insuliinia). WHO teki vuonna 1982 standardin uusimmat muutokset, jotka eivät vaikuttaneet yksikön määritelmään, vaan koskivat vain muutoksia, jotka liittyivät ihmisen geneettisesti muokatun insuliinin syntymiseen.

VIII jakso. Turvallisuus, paloturvallisuus ja

Jokaisen työntekijän ja insinöörityöntekijän on suoritettava työn vastaanotto ensisijainen opetus. Ensisijainen tiedotustilaisuus suorittaa esimies tai päällikkö seuraavan ohjelman mukaisesti:

Työsuojelua, turvallisuutta, teollista hygieniaa koskevan lainsäädännön tärkeimmät säännökset;

Erityisten vaatteiden ja henkilökohtaisten suojavarusteiden käytön tarkoitus ja menettely;

Tehtävät työpaikalla;

Vaatimukset työpaikan asianmukaiselle järjestelylle ja ylläpidolle;

Yleiset sähköturvallisuussäännöt, ilmanvaihdon arvo ja ilmanvaihtojärjestelmien käyttöä koskevat säännöt;

Tutustuminen tekniseen prosessiin, laitelaitteisiin ja kaikkiin vaarallisiin kohteisiin.

Kaikkien sähkölaitteiden on täytettävä "Sähkölaitteiden käyttöä koskevat säännöt". Sähkölaitteiden on oltava maadoitettuja. Kaikissa tuotanto- ja apuhuoneissa, asennuksissa, tiloissa tulisi olla palonsammutuslaitteet ja palontorjuntalaitteet.

Luvaton henkilöiden ottaminen kauppa on kielletty.

IX jakso. Luettelo valmistusohjeista

Työohjeita tilojen saniteettikäsittelyyn.

Ohjeet turvallisuuteen, teollisuuden puhtaanapitoon ja paloturvallisuuteen.

Ohjeet laitteiden korjauksen valmisteluun, toimittamiseen ja vastaanottamiseen.

Ohjeet raaka-aineiden ja lisäaineiden vastaanottamisesta;

Onnettomuuksien poistosuunnitelma.

Ohjeet liuoksen uudistamiseksi.

Pesuohjeet, jotka koskevat pullojen pesu-, kuivaus- ja sterilointioperaattoria.

Ohjeet putkilinjojen korjausta ja huoltoa koskeville mekaniikoille.

Insuliiniteknologia

INSULIN.docx

Luku 1. Kirjallisuuskatsaus

1.3. Ruiskut, kynät ja insuliinin annostelijat

1.4 Insuliinin injektiotekniikka ……………………………………...

1.5.Insuliinin imeytymistä ja vaikutusta vaikuttavat tekijät.........

1.6. Insuliinihoidon komplikaatiot ……………………………………..

1.7. Insuliinipakkaukset

1.8. Insuliinivarasto.

1,9. Moderni tapa parantaa insuliinihoitoa.....

Luku 2. Kokeellinen osa

Insuliini (latinalaiselta. Insula - saari) - peptidihormoni muodostuu haiman Langerhansin saarekkeiden beeta-soluihin. Se vaikuttaa monipuolisesti metaboliaan lähes kaikissa kudoksissa.

Diabetespotilaiden määrä maailmassa on 120 miljoonaa (2,5% väestöstä). 10–15 vuoden välein potilaiden määrä kaksinkertaistuu. Kansainvälisen diabeteslaitoksen (Australia) mukaan maailmassa on vuoteen 2010 mennessä 220 miljoonaa potilasta. Ukrainassa on noin I miljoonaa potilasta, joista 10-15% kärsii vakavimmasta insuliinista riippuvaisesta diabeteksesta (tyyppi I). Itse asiassa potilaiden määrä on 2-3 kertaa enemmän piilotettujen diagnoosien vuoksi.

Insuliinin löytämisen historia liittyy venäläisen lääkäri I.M. Sobolev (1800-luvun toinen puoli), joka osoitti, että sokeripitoisuutta ihmisveressä säätelee haiman erityinen hormoni.

Saatuaan ensimmäisen teollisuuserän insuliinia lähivuosina valtava tapa eristää ja puhdistaa. Tämän seurauksena hormoni oli saatavilla potilaille, joilla on tyypin 1 diabetes.

Vuonna 1935 Tanskan tutkija Hagedorn optimoi insuliinin toiminnan kehossa ehdottamalla pitkäaikaisia lääkkeitä.

Työni tarkoitus: Tutkimuksemme markkinoilla olevista insuliinivalmisteista, niiden eduista ja haitoista.

Tehtävät: Insuliinin hankkiminen teolliseen tuotantoon.

Luku 1. Kirjallisuuskatsaus

1.1 Insuliinin saaminen

Ihmisen insuliinia voidaan valmistaa neljällä tavalla:

1) täydellinen kemiallinen synteesi;

3) puolisynteettisellä menetelmällä käyttäen entsyymikemiallista substituutiota sianinsuliinin aminohapon alaniinin B-ketjun asemassa 30 treoniinin kanssa;

4) biosynteettinen menetelmä geenitekniikan tekniikalle. Kaksi viimeistä menetelmää mahdollistavat korkean puhtauden omaavan ihmisinsuliinin saamisen.

Harkitse insuliinin biosynteettistä hankkimista tämän menetelmän etujen kannalta.

Niinpä insuliinin biosynteettinen hyöty.

Ennen insuliinia tuottavan menetelmän käyttöönottoa rekombinantti-mikro-organismeilla tuotannossa oli vain yksi tapa saada insuliini nautaeläinten ja sikojen haimasyöpästä. Karjan haimasta peräisin oleva insuliini eroaa ihmisinsuliinista 3 aminohappotähteellä, ja sian rauhasista saatu insuliini on vain yksi aminohappotähde, eli se on lähempänä ihmisen insuliinia. Kuitenkin sellaisten proteiinien tuomisessa, jotka eroavat rakenteesta ihmisen proteiineista, jopa tällaisessa vähäisessä ilmentymässä voi esiintyä allergisia reaktioita. Tuloksena olevat vasta-aineet voivat myös inaktivoida tällaista insuliinia vieraana proteiinina.

Lisäksi, jotta saadaan 1 kg insuliinia, tarvitaan 35 tuhatta sikaa (jos tiedetään, että vuotuinen insuliinitarve on 1 tonni lääkettä). Toisaalta sama määrä insuliinia voidaan saada biosynteettisesti biosynteesillä 25 kuutiometrissä fermentorissa käyttäen rekombinanttia mikro-organismia Escherichia coli.

Biosynteettinen menetelmä insuliinin saamiseksi käytettiin 80-luvun alussa

Säilyttäkäämme uudelleen rekombinantti-insuliinin tuotantojärjestelmää (Eli Lilli- Eli-Lilly, Yhdysvallat):

Vaihe 1. Kemiallisen synteesin avulla syntyi nukleotidisekvenssejä, jotka koodaavat A- ja B-ketjujen muodostumista, eli synteettisiä geenejä.

2. vaihe. Kukin synteettisistä geeneistä viedään plasmidiin (geenisyntetisointisäike A viedään yhteen plasmidiin, ja geenisyntetisoiva juoste B viedään toiseen plasmidiin).

3. vaihe. Anna geeni, joka koodaa betagalaktosidaasin entsyymin muodostumista. Tämä geeni sisällytetään jokaiseen plasmidiin plasmidien voimakkaan replikaation aikaansaamiseksi.

4. vaihe. Plasmidit viedään Escherichia coli -soluun - Escherichia coli ja kaksi tuottajaviljelmää, yksi viljelmä syntetisoi A-ketjun, toisen B-ketjun.

5. vaihe. Aseta kaksi viljelmää fermentoriin. Keskiviikkona lisätään galaktoosia, joka aiheuttaa betagalaktosidaasin entsyymin muodostumista. Tässä tapauksessa plasmidit replikoituvat aktiivisesti ja muodostavat useita kopioita plasmideista ja siksi monet geenit, jotka syntetisoivat A- ja B-ketjuja.

6. vaihe. Solut hajottavat, erittävät A- ja B-ketjut, jotka liittyvät betagalaktosidaasiin. Kaikki tämä käsitellään syanogeenibromidilla ja A- ja B-ketjut pilkotaan beeta-galaktosidaasista. Tee sitten A- ja B-ketjujen lisäpuhdistus ja valinta.

7. vaihe. Kysteiinitähteet hapetetaan, sitoutuvat ja insuliini valmistetaan.

Tällä tavalla saatu insuliini on sen rakenteessa oleva ihmisinsuliini, joka alusta alkaen alentaa allergisten reaktioiden esiintymistä.

Puhdistetun ihmisen insuliinin saamiseksi biomassasta eristetty hybridiproteiini altistetaan kemialliselle entsymaattiselle transformaatiolle ja sopivalle kromatografiselle puhdistukselle (etu-, geeliä läpäisevä, anioninvaihto).

Venäjän tiedeakatemian instituutista saatiin rekombinanttinen insuliini käyttäen geneettisesti muokattuja E. coli -kantoja, menetelmä koostuu sen biologisen esiasteen synteesistä, joka mahdollistaa insuliini- ja B-ketjujen erillisen synteesin suorittamisen. Molekyylin pro-insuliiniosan tuottamiseksi E. colissa. plasmidi syötetään (se saadaan lisäämällä luonnollinen tai vieras DNA - näin saadaan rekombinantti-RNA-molekyyli). Plasmidi tarjoaa rekombinanttiproteiinin, joka on proteiinin johtosekvenssi ja fragmentti, synteesiä sekä ihmisen proinsuliinia, jossa on metioniinitähde (aminohappo) niiden välillä. Molekyylin pro-insuliiniosa erotetaan käsittelemällä etikkahapossa bromi- syaanilla (pilkkominen suoritetaan selektiivisesti - metioniinitähteellä). Seos (proinsuliiniosa ja johtosekvenssi) erotetaan kromatografialla. Seuraavassa vaiheessa, tuloksena olevalla proinsuliinisekvenssillä, suoritetaan ketjujen A ja B oikea keskinäinen järjestely, jonka suorittaa keskusosa - peptidi C. Seuraavassa vaiheessa sitoutuva C-peptidi eristetään entsymaattisella menetelmällä. Kromatografisen puhdistuksen sarjan, mukaan lukien ioninvaihto, geeli ja HPLC, jälkeen saan korkean puhtausasteen ihmisinsuliinia ja luonnollista aktiivisuutta.

Geneettisesti muokatun insuliinin laadunvalvonta merkitsee sitä, että kontrolloidaan lisäindikaattoreita, jotka kuvaavat rekombinantti- kannan ja plasmidin stabiilisuutta, ulkoisen geneettisen materiaalin puuttumista valmisteessa, ekspressoidun geenin identiteettiä jne.

1.2 Insuliinivalmisteet

Ihmisen insuliinivalmisteet kemiallista rakennetta varten ovat täysin identtisiä ihmisen insuliinin kanssa.

Insuliinivalmisteet jakautuvat toiminnan alkamisesta ja kestosta riippuen seuraaviin ryhmiin:
1) nopean ja ultraherkän vaikutuksen insuliinit;
2) lyhytvaikutteiset insuliinit (”yksinkertaiset” insuliinit);
3) keskipitkät insuliinit (”välituotteet”);
4) pitkävaikutteiset insuliinit;
5) "sekoitetut" insuliinit - eri kestoisten insuliinien yhdistelmä.

Eri nimiä sisältävien insuliinivalmisteiden määrä on useita kymmeniä, ja uusista insuliinien nimistä on tullut useita ulkomaisia, ja viime vuosina kotimaisia lääkealan yrityksiä lisätään vuosittain.

Nopeat ja ultraäänilinssit

Nopeat ja ultraherkät insuliinit sisältävät tällä hetkellä kolme uutta lääkettä - lispro (humalog), aspart (novoid, novolog) ja glulissiini (apidra). Niiden erityispiirre on toiminnan nopeampi alku ja loppu verrattuna tavanomaiseen ”yksinkertaiseen” insuliiniin. Uusien insuliinien nopea glukoosipitoisuutta alentava vaikutus johtuu niiden nopeutetusta imeytymisestä ihonalaisesta rasvasta. Uusien insuliinien erityispiirteet mahdollistavat ruiskeen ja ruoan saannin välisen ajan lyhentämisen, ravinnon jälkeisen glykemian tason vähentämisen ja hypoglykemian esiintyvyyden vähentämisen.

Lispro: n, aspartin ja glulissiinin vaikutus alkaa alueella 5 - 10-15 minuuttia, maksimivaikutus (vaikutuksen huippu) on 60 minuutin kuluttua, vaikutuksen kesto on 3 - 5 tuntia. Nämä insuliinit annetaan 5 - 15 minuuttia ennen ateriaa tai välittömästi ennen sitä. On todettu, että lisproinsuliinin antaminen välittömästi aterian jälkeen antaa myös hyvän glykeemisen kontrollin. On kuitenkin tärkeää muistaa, että näiden insuliinien antaminen 20 - 30 minuuttia ennen ateriaa voi johtaa hypoglykemiaan.

Potilaiden, jotka siirtyvät näiden insuliinien käyttöönottoon, on valvottava verensokeritasoja useammin, kunnes he oppivat korreloimaan kulutetun hiilihydraatin määrän ja insuliinin annoksen. Siten lääkkeiden annokset asetetaan kussakin tapauksessa erikseen.

Jos käytetään vain humalogia (lisproinsuliinia), käytetään uutta nopeaa tai aloittelijaa (aspartinsuliinia) tai apidraa (glulisiininsuliinia), niitä voidaan antaa 4-6 kertaa päivässä ja yhdessä pitkävaikutteisten insuliinien kanssa 3 kertaa päivässä. Ylimääräinen 40 U: n annos on sallittu poikkeustapauksissa. Nämä insuliinit, jotka ovat saatavilla injektiopulloissa, voidaan sekoittaa samaan ruiskuun ihmisinsuliinivalmisteilla, joilla on pidempi vaikutusaika. Kun tämä nopea insuliini kerätään ensin ruiskuun. Ruiskutus on toivottavaa tehdä välittömästi sekoittamisen jälkeen. Nämä insuliinit, jotka on valmistettu patruunoissa (erikoismuhvat), eivät ole tarkoitettu sekoittamisen valmistamiseksi muiden insuliinien kanssa.

Tämä on tärkeää!
Uudet nopeat insuliinit ovat käteviä aktiivista elämäntapaa käyttäville potilaille, niiden käyttöä suositellaan akuuteille infektioille, emotionaalista stressiä, hiilihydraattien määrän lisäämistä elintarvikkeissa, lääkkeitä, jotka edistävät hyperglykemiaa (kilpirauhashormonit, kortikosteroidit - prednisoloni jne.), Muiden intoleranssi insuliinivalmisteet tai post-ravitsemuksellinen hyperglykemia, joka on huonosti muiden insuliinien vaikutus. Jälleen kerran on korostettava, että nopean vaikutuksen omaavia insuliineja tulisi käyttää suoraan elintarvikkeiden saannin yhteydessä.

Insuliiniteknologia

Teknologinen järjestelmä

Insuliinin tyypit ja sen valmistusmenetelmät

Insuliinigeneettisesti muunnetun menetelmän tuotantoa koskevat säännöt

Etusivu> Esittely> Lääketiede, terveys

Insuliiniteknologia

INSULIN.docx

Lue Lisää Diabeteksesta

Diabeteksen Oireet

Glykeeminen Indeksi