Insuliiniteknologia

• Analyysit

Insuliini on yksi ihmisen kehon itse tuottamista hormoneista, erityisesti haima. Tämän aineen erittymisen rikkominen johtaa sellaisen vakavan sairauden syntymiseen kuin diabetes. Sen hoitoon synteettisen hormonin avulla, joka on pitkään eristetty karjan haimasta. Insuliinin tuottamiseen käytettyä tekniikkaa hyvin yleisen bakteerin - Escherichia coli tai hiivasienen - avulla on kuitenkin käytetty jo pitkään. Tämän menetelmän avulla voit välttää vieraiden proteiinien aiheuttamia allergisia reaktioita, joilla on pieni ero ihmisestä.

Teknologinen järjestelmä

Insuliinin tuotantoteknologia sisältää kaikki biotekniikan tuotteiden valmistuksen tärkeimmät vaiheet. Tuloksena on kiteinen lopputuote, jota käytetään sitten valmistamaan injektioliuoksia, joita käytetään vakavan diabetes mellituksen hoidossa tyypin I ja II tyypissä. Tämän hormonin pääasiallinen vaikutus kehossa ilmenee veren sisältämän glukoosin määrän vähenemisenä.

Insuliinin tuotannon vaiheet ovat seuraavat:

• Alustavat. Se harjoittaa veden ja ilman valmistusta ja puhdistamista, teollisuustilojen puhdistusta ja laitteiden sterilointia, henkilöstön tarkastusta, käsien käsittelyä ja steriilien kenkien ja vaatteiden myöntämistä. Myös alustavassa vaiheessa valmistetaan molekyyli- ketjujen, joista proteiini on koottu, ensisijainen kemiallinen synteesi. Ketju A sisältää 21 aminohappotähdettä ja ketju B sisältää 30 aminohappoa.
• Ravinteiden liuosten ja soluviljelyn valmistaminen. Elävän solun valmistamiseksi tuotetaan tarvittava yhdiste, vastaava geeni syötetään. Tätä varten plasmidi leikataan erityisillä entsyymeillä, rajoituksilla, ja tarvittavien yhdisteiden synteesiä koodaavat geenit ommellaan siihen. Sitten, käyttäen mikroinjektiomenetelmää, modifioitu plasmidi palautetaan soluun.
• Solususpension viljely. Geneettisesti muunnetut solut sijoitetaan ravintoaineliuokseen, jossa on kaikki kasvuun ja lisääntymiseen ja sterilointiin tarvittavat aineet. Viljelmän viljely tapahtuu erityisissä bioreaktoreissa, joissa esikäsitelty ilma syötetään. Reaktoriin lisätään määräajoin tietty määrä ravinneliuosta ja samanaikaisesti sama solususpensiotilavuus poistetaan.
• Kulttuurin jakaminen. Nesteen ja soluviljelmän erottaminen suoritetaan sedimentoimalla (sedimentaatio) erityisissä sedimentaattoreissa ja sitten suodattamalla, mikä sallii solujen eheyden säilymisen.
• Aineen kromatografinen puhdistus. Se suoritetaan sopivalla laitteella käyttäen erilaisia ​​menetelmiä, erityisesti etu-, anioninvaihto- ja geelipermeaatiokromatografiaa.
• Valkuaismolekyylin saaminen. Todellisessa biotekniikan vaiheessa syntyy tuottamattoman insuliinimolekyylin synteesi. Ja sen ketjujen kaksi osaa. Ne on ommeltu saatujen ketjujen hapettumisen ja taittamisen jälkeen, jolloin muodostuu disulfidisiltoja.
• Pakastekuivatus erityisessä uunissa, jonka jälkeen tuloksena oleva kiteinen valmiste tarkistetaan standardin mukaiseksi, pakataan, leimataan ja kuljetetaan kuluttajalle.

Yrityksemme tarjoaa suotuisilla ehdoilla valmiita tuotantolinjoja, joissa kaikki insuliinintuotantoteknologia on täysin noudatettu. Tarkkojen laskelmien, teknisen ja tietoturvan sekä henkilöstön koulutuksen ansiosta kattavan ohjelman puitteissa yhtiö on kannattavaa ja sen tuotteet ovat kysynnässä.

Insuliinin löytäminen

Nykyään diabetes vaikuttaa yli 400 miljoonaan ihmiseen planeetalla, mikä on noin 8% maailman aikuisväestöstä. Valtion rekisterin mukaan yli 3,3 miljoonaa ihmistä kärsii diabeteksesta Venäjällä (noin 300 tuhatta ihmistä kärsii tyypin 1 diabeteksesta, ja noin 3 miljoonaa ihmistä kärsii tyypin 2 diabeteksesta). Nämä luvut eivät kuitenkaan todennäköisesti vastaa todellista tilannetta. Kaikki nämä ihmiset, jotka elävät joka päivä, ymmärtävät, että heidän elämänsä riippuu insuliinista.

Ensimmäiset yritykset diabeteksen parantamiseksi tehtiin ennen aikamme. Muinaiset kreikkalaiset ja roomalaiset lääkärit käyttivät tätä hierontaa, voimistelua, kylpyjä, aromaterapiaa ja paljon muuta. 1800-luvulla diabeetikoille kehitettiin vähän hiilihydraattia sisältävä ruokavalio. Ensimmäinen yritys diabeteksen hoitoon insuliini-injektioilla tehtiin vuonna 1921. Kanadan tiedemies Frederick Bantingista tuli ensimmäinen henkilö, joka käytti insuliinihormonia diabeteksen torjumiseksi. Hän oli vain 32 koodia, kun hän sai lääketieteen Nobelin palkinnon. Hän loi lääkkeen tehokkaasti ja ilman sivuvaikutuksia väheni glukoosin tasoa 28,9: stä 6,7 mmol / l: iin. Tämä lääke antoi toivoa elämälle monille.

Vuonna 1869 tutkija Paul Langergans löysi haiman ryhmiä soluista, jotka myöhemmin nimettiin hänen nimensäään "Langerhansin saariksi". Tämän jälkeen insuliini eristettiin näiden saarekkeiden soluista. Insuliini on hormoni, joka säätelee metaboliaa, pääasiassa hiilihydraatteja (sokereita), mutta myös rasvoja ja proteiineja. Diabeteksessa, joka johtuu riittämättömästä insuliinialtistuksesta, syntyy monimutkainen aineenvaihduntahäiriö, verensokeritaso nousee (hyperglykemia), sokeri erittyy virtsaan (glykosuria), ja veren ketonirakenteissa (ketoasidoosi) esiintyy happaman rasvanpolttoa heikentäviä tuotteita.

Insuliinin löytämisen jälkeen monet tutkijat alkoivat kehittää menetelmiä tämän lääkkeen puhdistamiseksi, koska se on epäpuhtauksia, joilla on haitallinen vaikutus heikentyneeseen kehoon.

Agilent Technologies on maailman johtava analyyttisten laitteiden toimittaja. Kromatografia- ja spektrianalyysilaitteet yli vuoden ajan ovat auttaneet tutkijoita ympäri maailmaa ratkaisemaan lääkkeiden tärkeimmät ongelmat. Insuliinin puhtauden säätö ei ole poikkeus. Aiemmin näihin tarkoituksiin käytettiin klassista nestekromatografiaa, mutta saatiin melko hyväksyttäviä tuloksia:

Kun tutkijat ovat tehneet paljon tutkimusta, tutkijat osoittivat, että muodostunut insuliinipolypeptidi, jonka molekyylipaino on noin 6000, tunnistetaan tehokkaasti käyttämällä uusinta kehitystä poissulkukromatografian alalla.

Tällä uudella menetelmällä voidaan verrata "hyvää insuliinia", joka on säilytetty suositelluissa olosuhteissa ja "huono insuliini". Kun kaksi kromatogrammia oli päällekkäin toistensa kanssa, osoittautui, että insuliinivalmisteessa, joka varastoitiin haitallisissa olosuhteissa, kohdemolekyyli tuhottiin ja sen sijaan hajoamistuotteet tunnistettiin kromatogrammilla.

Insuliinivalmisteiden analysointi- ja standardointimenetelmien kehittäminen ja yhtenäistäminen käänteisfaasi-korkean paineen nestekromatografialla (RP HPLC) Pihtar Anatoly Vasilyevich

Väitöskirjan tulee mennä kirjastoon lähitulevaisuudessa.
Ilmoita ottamisesta

Opinnäytetyö - 480 ruplaa., Toimitus 10 minuuttia, vuorokauden ympäri, seitsemän päivää viikossa ja loma.

Tiivistelmä - 240 ruplaa, toimitus 1-3 tuntia, 10-19 (Moskovan aika), paitsi sunnuntai

Pihtar Anatoly Vasilyevich. Insuliinivalmisteiden analysointi- ja standardointimenetelmien kehittäminen ja yhtenäistäminen käänteisfaasi- korkean paineen nestekromatografialla (RP HPLC): väitöskirja. Lääketeollisuuden kandidaatti: 15.00.02 / Pihtar Anatoly Vasilievich; [Suojapaikka: Moskovan lääketieteellinen akatemia].- Moskova, 2005.- 139 s.: Il.

Väitöskirjan sisältö

LUKU 1. Kirjallisuuden tarkastelu 11

1. Insuliinin rooli diabeteksen hoidossa 11

2. Insuliinin biosynteesi ja biologinen vaikutus 12

3. Insuliinin 15 fysikaalis-kemiallisten ja farmaseuttisten ominaisuuksien yleiset ominaisuudet

4. Insuliinivalmisteet 24

5. Insuliinivalmisteiden valmistusmenetelmät, standardointi ja laadunvalvonta 31

6. HPLC: n käyttö insuliinin farmaseuttisessa analyysissä. 46

LUKU 2. Ongelmailmoitus 50

LUKU 3. Tutkimus eri tekijöiden vaikutuksesta insuliinin kromatografiseen käyttäytymiseen RP-HPLC-olosuhteissa 56

1. Menetelmät ja materiaalit 57

2. Tulosten keskustelu 62

2.1. Puskuriliuoksen 62 koostumuksen vaikutus

2.2. Natriumsulfaatin pitoisuuden vaikutus 68

2.3. Kromatografisen kolonnin lämpötilan vaikutus 70

2.4. Orgaanisen modifikaattorin 75 vaikutus

2.5. Oksastetun faasin 80 alkyyliradikaalin pituuden vaikutus

2.6. Kromatografiakolonnin 80 pituuden vaikutus

LUKU 4. Farmaseuttisten menetelmien parantaminen insuliinivalmisteiden analysoimiseksi RP HPLC 82: n perusteella

1. Optimaalisten olosuhteiden valinta insuliinin ja sen epäpuhtauksien kromatografiseen määritykseen lääkevalmisteissa 82

2. Menetelmän metrologiset ominaisuudet 84

3. Kehitettyjen menetelmien soveltaminen virallisten insuliinivalmisteiden testaamiseen 95

LUKU 5. Menetelmät isofaani-insuliinin injektoitavien annosmuotojen analysoimiseksi PF-HPLC-menetelmän perusteella 107

1. Ehdon valinta protamiinin kromatografiseen määritykseen isofaaninsuliinin 110 annosmuodoissa

2. Eri kalalajeista eristettyjen protamiinien kromatografisten profiilien tutkimus 121

3. Menetelmä protamiinin määrittämiseksi isofaani-insuliinivalmisteissa 123

4. Kehitetyn menetelmän validointi 125

Yleiset päätelmät 136

Viitteet 139

Insuliinin fysikaalis-kemiallisten ja farmaseuttisten ominaisuuksien yleiset ominaisuudet

Kemiallisesti insuliini on pieni globulaarinen proteiini, jonka molekyylipaino on enintään 6000 Da. Samalla on huomattava, että insuliini on yleinen nimi luonnollisen ja keinotekoisen alkuperän omaavien homologisten proteiinien koko perheelle, jolla on yhteinen biologinen aktiivisuus. Insuliinin proteiinilaji perustettiin vuonna 1928 [52]. Se on yksi proteiineista, jotka tuottavat biureettireaktion ja Paulin reaktion. Insuliinin rakenne oli täysin vakiintunut 50-luvun alussa. Eri alkuperää olevien insuliinien alkuaineiden kemialliselle koostumukselle on tunnusomaista taulukossa 1 annetut luvut [40].

Aminohappokoostumus. Useimmat insuliinimolekyylit sisältävät 51 aminohappotähdettä, joista 17 tunnetaan useimmissa tunnetuissa proteiineissa.

Tyypillinen piirre naudan, sian ja ihmisen insuliinin aminohappokoostumukselle on tryptofaani ja metioniini. Näiden insuliinityyppien aminohappokoostumus on esitetty taulukossa 2 [40,46].

Kaikkien insuliinityyppien varalta on kystiinin (6 puoli-kystiinitähteitä) pitoisuus. Lisäksi kaikentyyppinen insuliinimolekyyli sisältää 6 amidiryhmää (asparagiini, glutamiini).

Kun insuliinia vapautuu, pääaineksen mukana voidaan havaita insuliinin deamidoitujen muotojen fraktioita. Happamassa ympäristössä deamidaation prosessissa kaikki 6 amidiryhmää voidaan hajottaa asteittain, ja insuliinin muutosten elektroforeettinen ja kromatografinen liikkuvuus [40]. Deamidoitujen insuliinimuotojen muodostumista voidaan arvioida ammoniakin määrityksen tulosten perusteella. Insuliinin täysin amidimuodossa määritetään 6 moolia ammoniakkia 1 moolia proteiinia kohti, deamidoitujen muotojen osalta tämä arvo voi olla 5 - 0.

Insuliinin ensisijainen rakenne. Insuliinin primäärirakenne purettiin Sanger-ryhmässä 1945-1955. Käyttämällä useita kromatografisia menetelmiä, jotka mahdollistivat erilaisten peptidien, aminohappojen ja niiden johdannaisten erottamisen ja tunnistamisen, Sanger pystyi määrittämään naudan insuliinin primaarirakenteen [130,131,132,133,134,135]. Eri alkuperää olevien insuliinien jatkotutkimukset käyttäen erilaisia ​​fysikaalis-kemiallisia menetelmiä, mukaan lukien Edman-menetelmä täyden aminohapposekvenssin määrittämiseksi pitkissä peptideissä, vahvistivat Sangerin ja hänen rinnakkaislääkäriensä havainnot insuliinin rakenteesta [bb].

Tähän mennessä insuliinin ensisijainen rakenne on määritelty 24 lajin edustajissa, jotka kuuluvat neljään eläinluokkaan: nisäkkäät, linnut, kalat ja syklostomit [14]. Eri alkuperää olevan insuliinin tutkimus jatkuu [71,72,73].

Insuliinin rakenne eri eläimissä on samanlainen, mutta ei identtinen. Sen primaarirakenteessa ihmisen insuliini on samanlainen kuin sika-, koira-, siittiö- ja kani-insuliinit, jotka eroavat vain yhdestä aminohaposta [40]. Se eroaa nautaeläinten insuliinista kolmella aminohapolla. Ihmisinsuliini ei ole samanlainen kuin Guinean sikojen, lintujen ja kalojen insuliini [40]. Ihmisen, sian ja karjan insuliinien aminohapposekvenssin erot esitetään taulukossa 3.

Rakenteellisista eroista huolimatta kaikentyyppisillä insuliineilla on samanlainen biologinen aktiivisuus, ts. aiheuttaa hypoglykeemistä vaikutusta. Näytetyn biologisen aktiivisuuden suuruus riippuu kuitenkin voimakkaasti lajista ja on alueella 11 IU / mg (Pohjanmeren turska-insuliini) 62 IU / mg (kalkkuna ja kanan insuliini), kun taas ihmisinsuliinin aktiivisuus on noin 25-30 IU / mg [40]. Mitä suurempi eri alueiden väliset erot, sitä suurempi on vastaavan insuliinin biologisen aktiivisuuden ero.

Toiminnallisesti aktiivinen insuliinimolekyyli koostuu kahdesta polypeptidiketjusta (A- ja B-ketjut), jotka on kytketty disulfidisidoksilla; yksi sidos muodostuu molempien ketjujen seitsemännestä aminohappotähteestä, toinen disulfidisidos muodostuu A-ketjun 20. jäännöksestä ja B-ketjun 19. jäännöksestä (kuvio 2). Lisäksi insuliinimolekyylissä on kolmas disulfidisidos, joka on intrakaiini ja joka yhdistää kuudennen ja yhdeksännen A-ketjun tähteet [59, 117].

Toissijainen rakenne Erilaisia ​​fysikaalis-kemiallisia ja fysikaalisia tutkimusmenetelmiä käyttäen osoitettiin, että insuliinimolekyylillä on hyvin järjestetty tilarakenne (konformaatio), joka edistää tiettyjen biologisten toimintojen toteuttamista [14]. Natiivin insuliinin molekyylissä sekä cc-helix että p-fold-levyt ovat läsnä samanaikaisesti. Lisäksi on alueita, joilla on epäsäännöllinen rakenne ja rakenne <3-петли. Участки, имеющие форму а-спирали, составляют 57 %, 6 % приходится на [3-складчатую структуру, 10 % построено в виде р-петли, оставшиеся 27 % не имеют упорядоченной структуры (рисунок 3) [25].

Kun insuliinihappoliuosta (pH 2,3-2,5) kuumennetaan +100 ° C: n lämpötilassa ja jäähdytetään nopeasti -80 ° C: seen, muodostuu ns. Fibrillaarinen insuliini - hormoni on täysin inaktiivinen [27]. Fibrillaaristen insuliinikuitujen tuominen aktiivisen insuliinin liuokseen aiheuttaa spontaanin kvantitatiivisen insuliinin saostumisen fibrillien muodossa [14,17].

Insuliinivalmisteiden valmistusmenetelmät, standardointi ja laadunvalvonta

Eläinperäisten insuliinilajien saaminen. Naudanlihan ja sianlihan insuliinin teollinen tuotanto perustettiin melkein samanaikaisesti useissa maissa pian insuliinin löytämisen jälkeen vuonna 1921 [63]. Sittemmin insuliinin saamisen käsite on pysynyt lähes muuttumattomana (taulukko b) [17, 18]. Insuliinien eläinlajien tuotannossa käytettävät raaka-aineet ovat elintarvikkeisiin käytettävien teuraseläinten haima.

Insuliinin tuotannossa tärkein tehtävä on sen puhdistus - aineiden vapautuminen niihin liittyvistä epäpuhtauksista, jotka vähentävät biologista aktiivisuutta, aiheuttavat immunologisia reaktioita tai ovat potentiaalisesti vaarallisia potilaan terveydelle. Esimerkiksi useiden vuosien kuluttua, kun potilaan veressä on käytetty huonosti puhdistettua insuliinia, vasta-aineisiin voi liittyä jopa 5 000 IU: ta. Insuliinin vasta-aineet vaikuttavat merkittävästi sen vaikutukseen ja siten myötävaikuttavat diabeteksen labiiliin kulkuun.

Ensimmäinen menetelmä insuliinin puhdistamiseksi oli uudelleenkiteytys sinkkisuolojen läsnä ollessa. Vuonna 1945 osoitettiin, että insuliinin seitsenkertainen uudelleenkiteytys vähentää merkittävästi allergisten reaktioiden tasoa potilailla verrattuna virallisiin insuliinivalmisteisiin tuolloin [63].

Insuliininäytteiden heterogeenisyys kiteytymisen ja yksittäisen uudelleenkiteytyksen jälkeen esitetään käyttämällä erilaisia ​​menetelmiä: vastavirta-uutto (PE), jakautumiskromatografia (PX), ioninvaihtokromatografia (IOC), diskelektroforeesi (DEP) ja geelin poissulkukromatografia (GEC) [63].

Todettiin, että tärkeimmät samanaikaiset insuliinipitoisuudet ovat: proinsuliini, sen välituotteet, kovalenttinen insuliinidimeeri, mono-disamido-insuliini, monoarginiini ja monoeteeni sekä joukko suurimolekyylisiä yhdisteitä, joilla ei ole insuliinia. Tutkimusten tulosten yleinen johtopäätös, jossa huomioitiin havaittujen epäpuhtauksien immunologinen aktiivisuus [138], oli johtopäätös insuliiniaineiden lisäpuhdistuksen tarpeesta, joten DEF- ja GEC-menetelmiä analysoimalla löydettiin yksi komponentti - vastaava insuliini.

Insuliinin puhdistamisen ongelman ratkaisemiseksi vuonna 1950 ehdotettiin HEC-menetelmää ja vuonna 1970 anioninvaihtokromatografiaa (AOX). Todettiin, että AOX-menetelmällä puhdistettu insuliini sisältää noin 500 ppm (miljoonasosaa) epäpuhtauksia proinsuliiniaktiivisuudella [137]. Lisäpuhdistamalla insuliinia käyttäen korkean paineen nestekromatografiaa käänteisfaaseilla (RP HPLC), immunogeenisten fraktioiden pitoisuus pienenee niiden havaitsemisrajaan [63].

Katsaus insuliinin kromatografisen puhdistuksen alalla tapahtuneeseen kehitykseen on esitetty [96]. Insuliinia, joka on puhdistettu peräkkäin käyttäen IOC: ää ja GEC: tä, kutsutaan monokomponenttiseksi insuliiniksi [63]. Ihmisinsuliinin saaminen. Menetelmien etsiminen ihmisen insuliinin saamiseksi johtui kahdesta tilanteesta. Toisaalta raaka-aineongelman kiireellisyys eläininsuliinin tuotannossa toisaalta tieteen nopea kehitys tällä alueella antoi todellisen mahdollisuuden tuoda ajatus elämään. Vuonna 1979 ja 1981 melkein samanaikaisesti kehitettiin kaksi menetelmää ihmisen insuliinin saamiseksi - biosynteettiset ja puolisynteettiset [102,108]. Vuonna 1981 yhtiö Novo Nordisk aloitti ensimmäisen kerran maailmassa ihmisen puolisynteettisen insuliinin tuotannon. Yrityksen käyttämä menetelmä perustuu Al: n entsymaattiseen ja kemialliseen korvaamiseen sian insuliinimolekyylissä jäljellä olevan Tre: n kanssa [61]. Tämä menetelmä riippuu suoraan tarvittavan sian insuliinin määrän saamisesta, mikä vähentää sen taloudellista arvoa. Mahdollisuus saada ihmisen insuliinia biosynteettisellä menetelmällä ilmeni yhdistelmä-DNA-tekniikan kehittämisen yhteydessä [10]. Geneettisesti muokattujen insuliinintuotantoon liittyvät työt alkoivat noin 25 vuotta sitten. Vuonna 1978 ilmoitettiin, että saatiin E. coli -kanta, joka tuotti rotan proinsou-lingiä. Vuonna 1979 Genentechin tutkimukset kykenivät kloonaamaan aminohapposekvenssejä koodaavia geenejä E. coliin. insuliiniketjut A ja B, jotka sisältyvät pBR322-plasmidin p-halo-takidaasialueeseen [10.102]. Vuonna 1981 syntetisoitiin mini-C-proinsuliinin proinsuliinigeenianalogi, jossa 35-jäseninen C-peptidi korvattiin kuuden aminohapon segmentillä: arg-arg-gly-ser-lys-arg ja sen ilmentyminen E. colissa. Vuonna 1982 Eli Lilly aloitti maailman ensimmäisen ihmisinsuliinin teollisen tuotannon kahdella ketjuteknologialla, joka on kehitetty yhteistyössä Genentechin kanssa [102]. Tällä hetkellä on esitetty mahdollisuus saada ihmisinsuliinia erilaisten ilmentämisjärjestelmien avulla [3,10,101,102]. Taloudellisesta näkökulmasta on erityisen kiinnostavaa käyttää geneettisesti muunnettuja grampositiivisia E.coli-bakteereita, joista monet pidetään ylituottajina [3]. Samalla saavutettiin merkittävä edistyminen Saccharomices cerevisiae -hiivasoluilla [3,75]. Taulukossa 7 luetellaan tärkeimmät, yhteiset eri rekombinanttisen ihmisinsuliinin valmistusmenetelmät, teknisen prosessin vaiheet [3,10,63].

Kehitettyjen menetelmien soveltaminen virallisten insuliinivalmisteiden testaamiseen

Korkean paineen nestekromatografia (HPLC) on kolonnin nestekromatografian muunnos, jossa liikkuva faasi - eluentti - kulkee kolonnin täyttävän sorbentin läpi suurella nopeudella johtuen huomattavasta paineesta (jopa 400 x 105 Pa) kolonnin sisääntulossa [11].

Tapa, jolla analysoidaan monimutkaisia ​​aineiden seoksia, HPLC näytti hieman yli 30 vuotta sitten. Sorbenttien käyttö, jonka hiukkashalkaisija on 3–10 μm, aiheutti kromatografisen erotuksen tehokkuuden voimakkaan nousun verrattuna kolonnin nestekromatografian klassiseen versioon. Siksi HPLC: tä kutsutaan usein korkean suorituskyvyn nestekromatografiaksi (HPLC). HPLC: n käytön instrumentaalisia piirteitä kuvataan yksityiskohtaisesti lukuisissa käsikirjoissa [49.50] ja tärkeimpien farmakopean osissa [79, 150]. HPLC: ssä on kehitetty ja tuotettu laaja valikoima sorbentteja. Tutkimuksen tekijöiden [51] mukaan noin 100 yritystä maailmanlaajuisesti tuottaa yli 300 eri sorbentinimiä. Menetelmän historiaa, nykytilaa ja kehitysnäkymiä käsitellään katsauksissa [51] ja [77.78].

Erilaisissa muunnoksissaan HPLC-menetelmää käytetään laajalti farmaseuttisessa analyysissä (tuotannon valvonta ja lääkkeen laadun testaus). Menetelmä sisältyy kaikkiin maailman johtaviin farmakopöihin. Tätä menetelmää kuvataan täysin Euroopan ja Amerikan farmakopeassa. HPLC: tä käytetään lääkkeiden tunnistamiseen, puhtauden, molekyylipainon jako- koostumuksen ja kvantitatiivisen analyysin määrittämiseen. US Pharmacopoeia 28: ssa. noin 30% yksityisistä tuotteista liittyy HPLC: n käyttöön. Euroopan farmakopeassa 4. painos. tämä luku on noin 40%.

Ensimmäinen kromatografinen menetelmä insuliinikokeessa oli matalapaineinen geelinpoistonestekromatografia (GE ZhND). Erottamisen periaate HPLC-olosuhteissa perustuu eri kokoisten molekyylien erilaisiin kykyihin tunkeutua neutraalin geelin huokosiin, joka toimii kiinteänä faasina. Insuliinimonomeerin ja dimeerin hydrodynaaminen halkaisija on verrannollinen niiden molekyylipainoon ja on 2,69 ja 5,50 nm, vastaavasti [115].

Vuonna 1967 GE-IHDD-menetelmää käyttäen osoitettiin, että kiteyttämällä puhdistetut insuliinin kaupalliset valmisteet sisältävät epäpuhtauksia, joiden molekyylipaino ylittää insuliinin molekyylipainon [63]. Sian insuliinin kromatogrammeissa havaittiin kolme piikkiä, jotka tavanomaisesti osoitettiin a-, b- ja c-komponenteiksi. Sen jälkeen on ehdotettu useita kromatografisia järjestelmiä suurimolekyylisten epäpuhtauksien pitoisuuden säätämiseksi insuliinivalmisteissa. Erotus suoritettiin erittäin turpoavilla agaroosikerogeeleillä (Bio-Gel P-30, Bio-Rad Lab.) Tai dekstraanilla (Sephadex G-50, Pharmacia Fine Chemicals) käytettiin IF: tä 1-3 M etikkahapon liuosta [127]. Näiden sorbenttien suuri herkkyys puristukselle matriisin paisuntapaineen ylittävissä paineissa tekee näistä materiaaleista sopimattomia HPLC-tilassa.

Geelin poissulkemisen nestekromatografian käyttöä suurissa paineissa (GE HPLC) insuliinianalyysissä kuvattiin ensin vuonna 1980, kun oli kehitetty kovia makrohuokoisia sorbentteja, jotka ovat yhteensopivia veden kanssa ja kestävät suuria paineita. [151]: ssa erotus suoritettiin pylväillä Protein-Pak 1-125 (Waters), TSK-Gel SW 2000 (Toho Soda Corp.), Bondagel (Pharmacia) denaturointiolosuhteissa (7 M urean, mineraalihappojen ja ei-ionisen liuoksen yhdistelmä) pesuaineet). Insuliinianalyysin tarve denaturointiolosuhteissa liittyy insuliinin kykyyn aggregoitua liuokseen. Insuliinin erottamiseksi HPLC-HPLC-olosuhteissa on kuvattu myös "perinteisen" eluentin etikkahapon käyttöä [152]. Etikkahapon käytössä on useita etuja - vähäinen vaikutus erotettujen yhdisteiden luontaiseen rakenteeseen, saatavuus, alhaiset kustannukset, lisäksi tärkeä seikka on etikkahapon kyky estää insuliinin yhdistyminen.

Tällä hetkellä HPLC ghvd on farmakopean menetelmä, jolla tarkkaillaan suurimolekyylisten epäpuhtauksien pitoisuutta aineissa ja valmiissa annosmuodoissa. Menetelmää käytetään myös määrittämään protamiinin pitoisuus isofaani- insuliinivalmisteissa.

HPLC: n käyttö käänteisfaaseissa (RP HPLC) karjan ja sian insuliinin erottamiseksi ensimmäistä kertaa osoitti tämän menetelmän korkean tehokkuuden analysoimalla samanlaisen rakenteen omaavia insuliinimaisia ​​peptidejä.

Proteiinien ja polypeptidien erottamismekanismi RP-HPLC-olosuhteissa perustuu insuliinimolekyylien ja siihen liittyvien epäpuhtauksien erilaisiin hydrofobisuuksiin. Tähän mennessä on kuvattu useita kymmeniä menetelmiä eri alkuperää olevan insuliinin ja niiden johdannaisten, mukaan lukien proin-suliini, haiman polypeptidit, dezamido-johdannaiset, insuliinidimeeri, kromatografiseksi erottamiseksi. [126] osoitti mahdollisuuden erottaa kanan, kanin, lampaan ja hevosinsuliinin. Myös ihmisen, naudanlihan ja sianlihan insuliini erotettiin toisistaan. Lloyd ja Corran julkaisivat menetelmän naudanlihan, sianlihan, ihmisen insuliinien ja niiden vastaavien deamidoitujen muotojen erottamiseksi [104].

Erotus suoritetaan piihappogeeli-sorbenteilla modifioiduilla, metyyli-, butyyli-, oktyyli-, oktadekyyli- ja fenyyliryhmillä isokraattisessa tai gradienttimoodissa. PF: na käytetään orgaanisia modifioijia - asetonitriili, metyylialkoholi, isopropyylialkoholi, sekoitettuna vesipitoisten puskuriliuosten kanssa, jotka sisältävät epäorgaanisia suoloja ja ionihöyryreagensseja. Huipputunnistus suoritetaan pääasiassa spektrofotometrisellä menetelmällä aallonpituudella 190-220 nm, kuvataan myös fluorimetrisiä menetelmiä [103].

Aineen ja valmiiden insuliinimuotojen analysointi RP HPLC: llä on kuvattu yksityisissä artikkeleissa amerikkalaisessa ja Euroopan farmakopeassa [79, 150]. Menetelmää käytetään määritetyn ryhmän lääkkeiden testaamiseen "insuliinin aitouden", "siihen liittyvien proteiinien", "kvantitatiivisen määrityksen" ja "liuoksen insuliinin" suhteen.

Tutkimuskirjallisuudessa kuvataan myös ioninvaihto- ja affiniteettikromatografian käyttöä insuliinianalyysiin [44,102], mutta näitä menetelmiä ei ole laajalti käytetty farmakopeassa käytännössä.

Olosuhteiden valinta protamiinin kromatografiseen määritykseen isofaani- insuliinin annosmuodoissa

PF-ionivahvuuden lisääntyminen johtaa yleensä insuliinikapasiteettisuhteiden lisääntymiseen, joka voi johtua useista tekijöistä: - ionipitoisuuden lisääminen vähentää proteiinimolekyylin varautuneiden ryhmien ionisaatiotasoa, lisäämällä sen hydrofobisuutta / - korkeaa kationien konsentraatiota suojaa vapaita silanoliryhmiä kiinteässä pinnassa vaihe, joka heikentää proteiinin protonoitujen aminoryhmien ei-spesifistä sähköstaattista vuorovaikutusta matriisin kanssa; - korkea ionivahvuus vaikuttaa insuliinin spatiaaliseen rakenteeseen, minkä seurauksena sorbentin kanssa vuorovaikutukseen käytettävissä oleva pinta muuttuu. Epäorgaanisten suolojen pitoisuus FS: ssä vaikuttaa piikkien muotoon ja insuliinin ja desamido-Asn-insuliinin erotuksen selektiivisyyteen [143, 144]. Isokratisella eluoinnilla LiChrosorb Сів-sorbentilla 0,1 M natriumfosfaatiliuoksella (pH 2,3) saavutettiin tyydyttävä tulos vain, kun puskuriliuokseen lisättiin natriumsulfaattia konsentraatioon 0,1 M., käytä PF: ää puskuriliuosten perusteella, joiden natriumsulfaattipitoisuus on 0,2 M. Tällainen suuri natriumsulfaattipitoisuus vaikuttaa negatiivisesti kromatografiatulosten toistettavuuteen eluenttien kerrostumisen vuoksi, erittäin konsentroiduilla suolaliuoksilla on negatiivinen vaikutus kromatografisiin laitteisiin, mikä lyhentää sen käyttöikää. Ottaen huomioon, että farmakopean analyysimenetelmät kehitettiin yli 20 vuotta sitten, tuntui mielenkiintoiselta tutkia insuliinin kromatografista käyttäytymistä OF-HPLC: ssä viimeisimmän sukupolven kromatografisilla sorbenteilla, riippuen natriumsulfaatin pitoisuudesta. Samalla he yrittivät selvittää, onko PF: n natriumsulfaatin pitoisuuden väheneminen sallittua ilman kromatografisen järjestelmän erottelukyvyn merkittävää heikkenemistä. Tutkimuksen tuloksena havaittiin, että natriumsulfaatin pitoisuuden vaikutus PF: ään on erilainen siirretyn vaiheen tyypistä ja insuliinilajista riippuen. Sorbenteilla, joissa on oksastettuja ryhmiä C4 ja C ihmisen insuliinin ja desamido-Asn-ihmisen insuliinin piikkien erotuksen selektiivisyys ei riipu natriumsulfaattikonsentraatiosta. puskuriliuosta alueella 0,05 - 0,2 M. Diaspher-110-C18-sorbentilla tämän piikkiparin erotus selektiivisyys on maksimissaan 0,05 M ja minimissä 0,1 M (kaavio 4). Toisaalta insuliinin eläinlajien erottelun ja niiden vastaavien desamidoitujen AsnA21-muotojen selektiivisyys ei riipu liuoksen ionivahvuudesta, kun se erotetaan Diaspher-110-C18-sorbentilla. Sorbentilla, jossa on C8-siirretyt ryhmät, selektiivisyys nousee 1,25: stä 1,28: een lisäämällä natriumsulfaattikonsentraatiota (kuvio 4). C4-oksastettujen ryhmien sorbentilla erotusselektiivisyys naudanlihan insuliinin tapauksessa on maksimissaan 0,1 M natriumsulfaatissa ja minimissä 0,2 M: ssa. Sianlihan insuliinille ei ole ilmaistua enimmäismäärää natriumsulfaattipitoisuudessa 0,1 M, tässä tapauksessa ionisen kasvun osalta. voimat johtivat erotuksen selektiivisyyden vähenemiseen (kuvio 4). Tehokkaiden teoreettisten levyjen määrä kasvaa lisäämällä natriumsulfaattipitoisuutta. Poikkeuksena on ihmisen insuliinin käyttäytyminen sorbentissa Diasfer-110-C8 (kuva 5). Insuliinin ja desamido-Asn-insuliinin piikkien erotusaste kasvaa FS: n ionivahvuuden lisääntyessä riippumatta insuliinilajista ja oksastetun faasin tyypistä (kaavio b). Alentamalla natriumsulfaattikonsentraatiota 0,2 M: sta 0,1 M: iin valitun piikkiparin erottumisaste vähenee keskimäärin 5% ihmisen ja sian insuliinien osalta ja 10% naudan insuliinilla. Ottaen huomioon, että erotusasteen absoluuttinen arvo ylittää 2,0, kolonnin erottelukyvyn mitattu huononeminen ei mielestämme ole merkittävä. Niinpä natriumsulfaatin pitoisuus puskuriliuoksessa PF voidaan pienentää 2 kertaa verrattuna farmakopean analyysimenetelmiin.

Useimmissa tutkimuksissa proteiinien ja peptidien analysoinnista erotus suoritetaan huoneenlämpötilassa. Lisäksi jotkut tekijät osoittavat, että lämpötilan vaikutus erotuksen selektiivisyyteen on vähäinen [48]. Kuitenkin lisääntyvässä lämpötilassa kiihdytetään kiinteän ja liikkuvan faasin välistä massanvaihtoprosessia, mikä johtaa peptidien retentioajan vähenemiseen ja piikkien supistumiseen.

Insuliiniteknologia

Insuliinin erityksen rikkominen. Affiliate-valokuvauksen käyttö. Insuliinin järjestelmä. Proinsuliinin ekspressio E. colin soluissa. Lähestymistavat diabeteksen ongelman ratkaisemiseksi. Biotekniikan vaikutus ei-peptidihormoneiden teolliseen tuotantoon.

Lähetä hyvä työsi tietopohjassa on yksinkertainen. Käytä alla olevaa lomaketta.

Opiskelijat, jatko-opiskelijat, nuoret tutkijat, jotka käyttävät tietopohjaa opinnoissaan ja työstään, ovat hyvin kiitollisia teille.

Lähetetty http://www.allbest.ru/

Lähetetty http://www.allbest.ru/

Lähetetty http://www.allbest.ru/

KAZAKSTANIN TASAVALLAN HARJOITUKSEN JA TIETEEN MINISTERI

KAZAKH AGRO-TECHNICAL UNIVERSITY NIMED S.SEYFULLINin jälkeen

Mikrobiologian ja biotekniikan laitos

"Biotekniikka mokroorganizmov" -alalla

Aiheesta: insuliinin teknologia

Valmistunut: Myrzabek M? Ldir Kurbanbek?

Tarkistettu: Akimbaeva A.K. (k. B. N.)

LYHENTEET JA SYMBOLIT

1. Löytöhistoria

2. Insuliinin saaminen bioteknologiaan

3. Tapoja saada ihmisinsuliinia

4. Proinsuliinin ilmentyminen E. colin soluissa

5. Insuliinin puhdistus

6. Annostus ja antaminen

Tässä kurssissa käytettiin seuraavia määritelmiä:

Proteiinikantaja - tarjoaa hybridiproteiinin kuljetuksen solun tai viljelyalustan periplasmiseen tilaan;

Affinity-komponentti - helpottaa merkittävästi hybridiproteiinin valintaa.

Insuliini (latinalaiselta. Insula - saari) - peptidihormoni muodostuu haiman Langerhansin saarekkeiden beeta-soluihin.

Interleukiinit ovat sytokiinien ryhmä, joka syntetisoidaan pääasiassa leukosyyttien avulla (tästä syystä päätettiin "-leukiini").

Proinsuliini on haiman saarekkeen B-solujen syntetisoiman insuliinin esiaste.

Kromatografia (kreikkalaisesta. Chroma, kromatot - väri, maali), fysikaalis-kemiallinen menetelmä seosten erottamiseksi ja analysoimiseksi perustuen niiden komponenttien jakautumiseen kahden vaiheen välillä - kiinteä ja liikkuva (eluentti), joka virtaa kiinteän.

Kapselointi - ohjelmointikielimekanismi, joka rajoittaa pääsyä osiin, jotka muodostavat objektin (menetelmät ja ominaisuudet), tekee niistä yksityisiä, toisin sanoen vain kohteen sisällä.

Fuusioproteiini (fuusioproteiini, myös kimeerinen yhdisteen proteiini) on proteiini, joka on saatu yhdistämällä kaksi tai useampia geenejä, jotka alun perin koodasivat erillisiä proteiineja.

Hormonit (kreikkalaisilta. Hormao - tuovat liikkeelle, indusoivat), hormonit, biologisesti aktiiviset aineet, joita tuottavat endokriiniset rauhaset tai endokriiniset rauhaset ja jotka erittyvät suoraan veriin.

Diabetes mellitus on ryhmä hormonaalisia sairauksia, jotka kehittyvät hormoninsuliinin absoluuttisen tai suhteellisen vajaatoiminnan seurauksena.

Kapselointi - ohjelmointikielimekanismi, joka rajoittaa pääsyä osiin, jotka muodostavat objektin (menetelmät ja ominaisuudet), tekee niistä yksityisiä, toisin sanoen vain kohteen sisällä.

Somatostatiini on Langerhansin haiman saarekkeiden delta-solujen hormoni sekä yksi hypotalamuksen hormoneista.

Radioimmuunianalyysi on menetelmä biologisesti aktiivisten aineiden (hormonit, entsyymit, lääkkeet jne.) Kvantitatiiviseksi määrittämiseksi biologisissa nesteissä, jotka perustuvat halutun stabiilin kilpailukykyiseen sitoutumiseen ja niiden kaltaisiin radionuklidileimattuihin aineisiin, joilla on spesifisiä sitoutumisjärjestelmiä.

LYHENTEET JA SYMBOLIT

HPLC - Korkean suorituskyvyn nestekromatografia

cDNA - komplementaarinen deoksiribonukleiinihappo

Insuliinin pääasiallisena tehtävänä on varmistaa solukalvojen läpäisevyys glukoosimolekyyleille. Yksinkertaistetussa muodossa voidaan sanoa, että hiilihydraatit, mutta myös kaikki ravintoaineet, jaetaan lopulta glukoosiin, jota käytetään muiden hiilipitoisten molekyylien syntetisoimiseen, ja se on ainoa polttoainemuoto soluasemille - mitokondriot. Ilman insuliinia solukalvon läpäisevyys glukoosiin laskee 20-kertaiseksi, ja solut kuolevat nälkään, ja veren liuennut ylimääräinen sokeri myrkyttää kehoa.

Beetasolujen tuhoutumisesta johtuva insuliinierityksen heikentyminen - absoluuttinen insuliinipuutos - on keskeinen tekijä tyypin 1 diabeteksen patogeneesissä. Insuliinin vaikutuksen rikkoutuminen kudokseen - suhteellinen insuliinipuutos - on tärkeä paikka tyypin 2 diabeteksen kehittymisessä.

Affiniteettikromatografian käyttö on vähentänyt merkittävästi valmisteessa olevien kontaminoivien proteiinien pitoisuutta, jolla on suurempi molekyylipaino kuin insuliinilla. Tällaisia ​​proteiineja ovat proinsuliini ja osittain pilkotut proinsuliinit, jotka kykenevät indusoimaan antiinsuliinivasta-aineiden tuotannon.

Ihmisen insuliinin käyttö hoidon alusta minimoi allergisten reaktioiden esiintymisen. Ihmisen insuliini imeytyy nopeammin ja lääkkeen muodosta riippumatta on lyhyempi vaikutusaika kuin eläininsuliinilla. Ihmisen insuliinit ovat vähemmän immunogeenejä kuin sianliha, erityisesti naudan ja sian insuliinien sekoitus.

Tämän kurssityön tarkoitus on tutkia insuliinin teknologiaa. Seuraavien tavoitteiden saavuttamiseksi asetettiin:

1. saada insuliini bioteknologiaan

2. Tapoja saada insuliinia

H. Insuliinipuhdistus

Insuliinin löytämisen historia liittyy venäläisen lääkäri I.M. Sobolev (1800-luvun toinen puoli), joka osoitti, että sokeripitoisuutta ihmisveressä säätelee haiman erityinen hormoni.

Vuonna 1922 eläimen haimasta eristettyä insuliinia esiteltiin ensimmäistä kertaa 10-vuotiaalle pojalle, diabeetikko ylitti kaikki odotukset, ja vuosi myöhemmin amerikkalainen yritys Eli Lilly julkaisi ensimmäisen eläininsuliinivalmisteen.

Saatuaan ensimmäisen teollisuuserän insuliinia lähivuosina valtava tapa eristää ja puhdistaa. Tämän seurauksena hormoni oli saatavilla potilaille, joilla on tyypin 1 diabetes.

Vuonna 1935 Tanskan tutkija Hagedorn optimoi insuliinin toiminnan kehossa ehdottamalla pitkäaikaisia ​​lääkkeitä.

Ensimmäiset insuliinikiteet saatiin vuonna 1952, ja vuonna 1954 englantilainen biokemisti G. Senger selvitti insuliinin rakenteen. Menetelmien kehittäminen hormonin puhdistamiseksi muista hormonaalisista aineista ja insuliinin hajoamistuotteista mahdollisti homogeenisen insuliinin saamisen, jota kutsutaan yksikomponenttiseksi.

70-luvun alussa. Neuvostoliiton tutkijat A. Yudaev ja S. Shvachkin ehdottivat insuliinin kemiallista synteesiä, mutta tämän synteesin toteuttaminen teollisessa mittakaavassa oli kallista ja kannattamatonta.

Tulevaisuudessa insuliinien puhdistusaste parani asteittain, mikä heikensi insuliinialergioiden, munuaisten vajaatoiminnan, näköhäiriöiden ja immuuninsuliiniresistenssin aiheuttamia ongelmia. Tehokkain hormoni oli tarpeen diabetes mellituksen korvaushoidolle - homologiselle insuliinille eli ihmisinsuliinille.

80-luvulla molekyylibiologian edistyminen mahdollisti sekä ihmisen insuliiniketjujen syntetisoinnin käyttäen E. colia, jotka sitten yhdistettiin biologisesti aktiiviseen hormonimolekyyliin, ja rekombinantti-insuliini saatiin Venäjän tiedeakatemian bioorgaanisen kemian instituutissa käyttäen E.coli-geneettisesti muokattuja kantoja.

2. Insuliinin saaminen bioteknologiaan

Insuliini, Langerhansin haiman saarekkeiden peptidihormoni, on diabetes mellituksen pääasiallinen hoito. Tämä tauti johtuu insuliinin puutoksesta ja se ilmenee veren glukoosipitoisuuden lisääntymisenä. Viime aikoihin asti insuliini saatiin härkän ja sian haimasta. Lääkeaine erosi ihmisinsuliinin 1-3 aminohapposubstituutiosta, joten allergiset reaktiot olivat vaarassa erityisesti lapsilla. Insuliinin laajaa terapeuttista käyttöä rajoitti sen korkea hinta ja rajalliset resurssit. Kemiallisella modifikaatiolla eläimistä peräisin oleva insuliini tehtiin erottamattomaksi ihmisestä, mutta tämä tarkoitti tuotteen lisäkustannuksia [1].

Vuodesta 1982 Eli Lilly on tuottanut geneettisesti muokattua insuliinia, joka perustuu E. colien ja B-ketjujen erilliseen synteesiin. Tuotteen hinta on vähentynyt merkittävästi, tuotettu insuliini on identtinen ihmisen kanssa. Vuodesta 1980 lähtien lehdistössä on raportoitu proinsuliinigeenin, joka on hormonin prekursori, kloonauksesta, joka kulkee kypsään muotoon, jolla on rajoitettu proteolyys.

Kapselointitekniikka liittyy myös diabeteksen hoitoon: haiman solut kapselissa, jotka on kerran otettu potilaan kehoon, tuottavat insuliinia vuoden kuluessa.

Integrated Genetics on käynnistänyt follikkelia stimuloivien ja luteinisoivien hormonien tuotannon. Nämä peptidit koostuvat kahdesta alayksiköstä. Esityslistalla on kysymys hermoston oligopeptidhormonien teollisesta synteesistä, 5 aminohappotähteestä ja endorfiinista, morfiinianalogeista. Näiden peptidien järkevällä käytöllä lievennetään kipua, luodaan hyvä mieliala, tehostetaan, kiinnitetään huomiota, parannetaan muistia, järjestetään nukkuminen ja herätys. Esimerkkinä geenitekniikan menetelmien onnistuneesta soveltamisesta on β-endorfiinin synteesi käyttäen edellä kuvattua hybridiproteiiniteknologiaa toisen peptidi- hormonin, somatostatiinin [2] suhteen.

3. Tapoja saada ihmisinsuliinia

Historiallisesti ensimmäinen tapa saada insuliinia terapeuttisiin tarkoituksiin on eristää tämän hormonin analogit luonnollisista lähteistä (naudan- ja sikojen haimasaaret). Viime vuosisadan 20-luvulla todettiin, että naudan ja sian insuliinit (jotka ovat lähinnä ihmisen insuliinia rakenteessa ja aminohapposekvenssissä) osoittavat ihmisen elimistössä aktiivisuutta, joka on verrattavissa ihmisinsuliiniin. Tämän jälkeen naudan tai sian insuliinia käytettiin pitkään tyypin 1 diabeteksen hoitoon. Jonkin ajan kuluttua osoitettiin kuitenkin, että joissakin tapauksissa naudan ja sian insuliinien vasta-aineet alkavat kerääntyä ihmiskehoon, mikä siten poistaa niiden vaikutukset.

Toisaalta yksi tämän insuliinin saantimenetelmän eduista on raaka-aineiden saatavuus (nautaeläimet ja sian insuliini voidaan helposti saada suurina määrinä), jolla oli ratkaiseva merkitys kehitettäessä ensimmäistä menetelmää ihmisen insuliinin saamiseksi. Tätä menetelmää kutsutaan puolisynteettiseksi [3].

Tässä menetelmässä ihmisen insuliinin tuottamiseksi sian insuliinia käytettiin raaka-aineena. B-ketjun C-terminaalinen oktapeptidi pilkkoi puhdistetun sian insuliinin, minkä jälkeen syntetisoitiin ihmisen insuliinin C-terminaalinen oktapeptidi. Sitten se kiinnitettiin kemiallisesti, suojaryhmät poistettiin ja saatu insuliini puhdistettiin. Kun testataan tätä menetelmää insuliinin saamiseksi, saadun hormonin täydellinen identiteetti ihmisen insuliiniin näytettiin. Tämän menetelmän pääasiallinen haitta on tuloksena olevan insuliinin korkeat kustannukset (jo nyt oktapeptidin kemiallinen synteesi on kallis, erityisesti teollisessa mittakaavassa).

Tällä hetkellä ihmisen insuliinia saadaan pääasiassa kahdella tavalla: modifioimalla sian insuliinia synteettisellä entsymaattisella menetelmällä ja geenitekniikan menetelmällä.

Ensimmäisessä tapauksessa menetelmä perustuu siihen, että sian insuliini eroaa ihmisen insuliinista Ala30Thr B-ketjun C-päässä olevalla yksittäisellä substituutiolla. Alaniinin korvaaminen treoniinilla suoritetaan alaniinin entsyymikatalysoidulla katkaisulla ja sen sijaan kiinnitetään reaktioseoksessa läsnä oleva karboksyylisuojattu treoniinitähde suuressa ylimäärässä. Suojaavan O-tert-butyyliryhmän pilkkomisen jälkeen saadaan ihmisinsuliini. (kuva 1)

Kuva 1 - Kaavio menetelmistä ihmisen insuliinin tuottamiseksi

Insuliini oli ensimmäinen proteiini, joka saatiin kaupallisiin tarkoituksiin käyttäen rekombinantti-DNA-tekniikkaa. Geneettisesti muokatun ihmisen insuliinin saamiseksi on kaksi pääasiallista lähestymistapaa. Ensimmäisessä tapauksessa erilliset (eri tuottajakannat) tuottavat molempia ketjuja, joita seuraa molekyylin taittuminen (disulfidisiltojen muodostuminen) ja misoformin erottaminen. Toisessa valmistuksessa esiasteen muodossa (proinsuliini), jota seuraa entsymaattinen pilkkominen trypsiinillä ja karboksipeptidaasilla. In hormonin aktiiviseen muotoon. Tällä hetkellä edullisin on insuliinin tuotanto prekursorina, joka varmistaa disulfidisillojen oikean sulkemisen (ketjujen erillisen tuotannon tapauksessa, peräkkäiset denaturointisyklit, misoformin ja renaturaation erottaminen suoritetaan [3]).

Molemmissa lähestymistavoissa on mahdollista saada sekä lähtöaineet (A- että B-ketjut tai proinsuliini) sekä osana hybridiproteiineja. A- ja B-ketjujen tai proinsuliinin lisäksi voi esiintyä hybridiproteiinien koostumusta:

1) kantajaproteiini - varmistetaan hybridiproteiinin kuljetus solun tai viljelyalustan periplasmiseen tilaan;

2) affiniteettikomponentti - helpottaa merkittävästi hybridiproteiinin valintaa.

Samalla molemmat näistä komponenteista voivat olla samanaikaisesti hybridiproteiinin koostumuksessa. Lisäksi, kun luodaan hybridiproteiineja, voidaan käyttää moniulotteisuuden periaatetta (toisin sanoen hybridiproteiinissa on useita kopioita kohdepolypeptidistä), mikä mahdollistaa kohdetuotteen saannon huomattavan kasvun [4].

Käytimme JM 109 N1864 -kantaa nukleotidisekvenssillä, joka oli upotettu plasmidiin, joka ilmentää hybridiproteiinia, joka koostuu lineaarisesta proinsuliinista ja Astaphylococcusaureus -proteiinifragmentin fragmentista, joka on kiinnittynyt N-päähänsä metioniinitähteen kautta. Rekombinanttikankaan solujen tyydyttyneen biomassan viljely takaa hybridiproteiinin tuotannon alkamisen, jonka eristäminen ja peräkkäinen muuntaminen intubilla johtaa insuliiniin. Toinen ryhmä tutkijoita sai bakteeri-ilmentämisjärjestelmässä fuusio-rekombinanttiproteiinin, joka koostui ihmisen proinsuliinista ja polyhistidiinihän, joka oli kiinnitetty siihen metioniinitähteen kautta. Se eristettiin käyttäen kelaattikromatografiaa inkluusiokappaleiden Ni-agaroosipylväissä ja digestoitiin syanogeenibromidilla. Kirjoittajat totesivat, että eristetty proteiini on S-sulfuroitu. Saadun proinsuliinin kartoitus- ja massaspektrometrianalyysi, joka puhdistettiin ioninvaihtokromatografialla anioninvaihtimella ja RP (käänteisfaasi) HPLC: llä (korkean suorituskyvyn nestekromatografia), osoitti disulfidisiltojen läsnäolon, jotka vastaavat natiivin ihmisen proinsuliinin disulfidisiltoja. Siinä kerrottiin myös uuden, parannetun menetelmän kehittämisestä ihmisen insuliinin saamiseksi geenitekniikan menetelmillä prokaryoottisissa soluissa. Kirjoittajat totesivat, että sen rakenteessa ja biologisessa aktiivisuudessa saatu insuliini on identtinen haimasta eristetyn hormonin kanssa [5].

Äskettäin on kiinnitetty erityistä huomiota yksinkertaistamaan menetelmää rekombinantti-insuliinin tuottamiseksi geenitekniikan menetelmillä. Täten fuusioproteiini, joka koostui interleukiinin johtopeptidistä, joka oli kiinnittynyt proinsuliinin N-päähän, saatiin lysiinitähteellä. Proteiini ilmentyi tehokkaasti ja lokalisoitui inkluusiokappaleissa. Eristämisen jälkeen proteiini pilkottiin trypsiinillä insuliinin ja C-peptidin tuottamiseksi. Toinen tutkijaryhmä toimi samalla tavalla. Fuusioproteiini, joka koostui proinsuliinista ja Staphylococcus-proteiinin A kahdesta synteettisestä domeenista, jotka sitovat IgG: tä, lokalisoitiin inkluusiokappaleissa, mutta niillä oli korkeampi ilmentymistaso. Proteiini eristettiin affiniteettikromatografialla käyttäen IgG: tä ja käsiteltiin trypsiinillä ja karboksipeptidaasilla B. Tuloksena saatu insuliini ja C-peptidi puhdistettiin RP-HPLC: llä. Kun muodostetaan fuusiorakenteita, kantajaproteiinin ja kohdepolypeptidin massasuhde on hyvin merkittävä. Näin kuvataan fuusiorakenteiden suunnittelu, jossa proteiinia, joka sitoo ihmisen seerumin albumiinia, käytettiin kantajapolypeptidinä. Yksi, kolme ja seitsemän C-peptidiä kiinnitettiin siihen. C-peptidit yhdistettiin päähän perustuen käyttäen aminohappoa välikappaleita, jotka sisälsivät Sfi I-restriktiokohdan, ja kaksi arginiinitähdettä välikappaleen alussa ja lopussa lopetettaessa proteiini trypsiinillä. HPLC-katkaisutuotteet osoittivat, että C-peptidi pilkotaan kvantitatiivisesti, ja tämä sallii multimeeristen synteettisten geenien menetelmän tuottamisen kohdepolypeptidejä teollisessa mittakaavassa.

Mutantin proinsuliinin saaminen, joka sisälsi Arg32Tyrin korvaamisen. Tämän proteiinin yhteisellä katkaisulla trypsiini ja karboksipeptidaasi B muodostivat natiivin insuliinin ja C-peptidin, joka sisälsi tyrosiinitähteen. Jälkimmäistä käytetään 125I-leimauksen jälkeen aktiivisesti radioimmunomäärityksessä [6].

Insuliinin laadunvalvonta

Sisältö

1. Yleistä insuliinin saamisesta 5

2. Menetelmät insuliinin laadun kontrolloimiseksi 8

Viitteet 17

Poimi töistä

1–2% Euroopan väestöstä kärsii diabeteksesta, ja noin 20% näistä potilaista ei voi olla olemassa ilman insuliinia. Koska ensimmäiset kokeet insuliinin käytöstä diabeteksen hoidossa vuonna 1922, tämä hormoni eristettiin eläinten haimasta (lehmät ja siat). Eläininsuliini eroaa hieman ihmisinsuliinin aminohapposekvenssistä.

Ihmisten ja sikojen insuliinit ovat erityisen lähellä: sian insuliinissa B-ketjun C-terminaalinen treoniini korvataan alaniinilla. Lehmä ja ihmisen insuliini eroavat kolmesta aminohappotähteestä. Nämä erot johtivat naudan insuliinin lisääntyneeseen immunogeeniseen aktiivisuuteen verrattuna sian insuliiniin.

Lähes kaikilla potilailla, joita hoidettiin lehmän insuliinilla, oli vasta-aineita insuliiniin veressä. Insuliinin antigeeniset ominaisuudet määritettiin myös osittain sen epäpuhtauksilla. Todennäköisimmin vasta-aineiden muodostuminen insuliiniin selitti joitakin pieniä sivuvaikutuksia, kun ruiskutettiin lehmän insuliinia, esimerkiksi ihonalaisen rasvan atrofiaa uudelleen injektiokohdassa. Hyvin puhdistetun insuliinin tapauksessa nämä vaikutukset puuttuvat.

Tämän jälkeen saatiin geenitekniikan ja E. colin avulla ihmisen insuliini.

E. colilla saatu ihmisen insuliini oli ensimmäinen "geneettisesti muokattu" proteiini, joka oli testattu ihmisillä. Terveillä vapaaehtoisilla tehdyissä kokeissa todettiin, että se on turvallista (ei aiheuta allergisia ja muita ei-toivottuja reaktioita) ja että se kykenee vähentämään veren glukoosipitoisuutta ihon alle tai laskimoon.

Tällä hetkellä tällainen ihmisen insuliini saadaan monilta diabeetikoilta maailmanlaajuisesti. Tätä edeltivät kliiniset tutkimukset, joissa tutkittiin aineenvaihdunnan muutoksia ja immunologisia vaikutuksia.

Aiheemme merkitys on, että hallitsematon tai huonosti valvottu tuotanto voi johtaa saastuneiden insuliinivalmisteiden vapautumiseen, mikä puolestaan ​​voi johtaa haitallisiin kliinisiin seurauksiin.

Tämän työn tarkoituksena on tutkia insuliinin laadunvalvonnassa käytettyjä menetelmiä.

Viitteet

GOST R 52249-2004 "Lääkkeiden tuotannon ja laadunvalvonnan säännöt" 2004

OFS 42-0002-00 ”Bakteerien endotoksiinit” 2000

OFS 42-0126-09 "Insuliinin biologinen testaus"

Venäjän federaation farmakopean artikkeli FS 42-2620-97. 1997

Bairamashvili D.I. Ihmisen insuliinin geenitekniikka: menestykset ja näkymät // Venäjän kemiallinen lehti. - 2005. - T. XLIX. - № 1. - s. 34-45.

Goncharenko G.G. Biotekniikan perusteet: Opetusmenetelmä. monimutkainen. spec. / G.G. Goncharenko, A.V. Kruk, E.M. Stepanova, A.A. Surkov, S.A. Zyatkov; Min. sov. RB. - Gomel: EI “GGU im.F. Skaryna, 2008. - 282 s.

Ryabko, Yu.S., Lukin, OV, Shepel, E.N. Kineettisen kromogeenisen menetelmän soveltaminen bakteerien endotoksiinin (LAL-testi) määrittämiseen geneettisesti muokatun ihmisen insuliinin puhdistustekniikassa // Biofarmaseuttinen julkaisu - 2009. - Osa 1. - №1. - s. 34-37.