Glukoosin määrittäminen glukoosioksidaasimenetelmällä

Analyysit

Glukoosipitoisuuden määrittäminen veressä on yksi useimmiten tehdyistä biokemiallisista tutkimuksista laboratorioissa.

Glukoosioksidaasimenetelmä glukoosin määrittämiseksi veressä ja virtsassa perustuu glukoosin hapettumisen reaktioon glukoosioksidaasin entsyymin läsnäollessa vetyperoksidin muodostumiseen, joka puolestaan hapettaa peroksidaasia hapettamalla orthotolidiinia värillisten tuotteiden muodostamiseksi; o Värillisten tuotteiden määrä lupaa glukoosipitoisuuden.

Koska glukoosioksidaasimenetelmällä pyritään tunnistamaan glukoosi, eikä kaikkia sokerityyppejä, sitä käytetään seuraavien sairauksien differentiaalidiagnoosissa:

Glukoosioksidaasimenetelmän periaate glukoosin määrittämiseksi

Glukoosi entsyymin glukoosioksidaasin läsnä ollessa hapetetaan ilmakehän hapella, jolloin muodostuu vetyperoksidia reaktion aikana. Vetyperoksidi peroksidaasientsyymin läsnä ollessa hapettaa ortotolutidiinia, jolloin muodostuu värillinen yhdiste, jonka värin intensiteetti on verrannollinen glukoosipitoisuuteen. Tämän menetelmän avulla voit määrittää glukoosin tason veriplasmassa, seerumissa ja aivo-selkäydinnesteessä.

Normaali verensokeri, mmol / l

- plasmassa, natsheartse

vastasyntyneet - 1,7 - 4,2
6–15-vuotiaat lapset - 3,3 - 5,4
aikuiset (miehet, naiset) - 3,9 - 5,6

- seerumissa, natsheartse

vastasyntyneet - 2,6 - 4,2
lapset 6 viikosta 2 vuoteen - 3,3 - 5,4
aikuiset (miehet, naiset) - 3,9 - 5,6

Tarvittavat reagenssit glukoosin määrittämiseksi glukoosioksidaasimenetelmällä

1. Natriumkloridi 9 grammaa / litra (isotoninen liuos): valmistetaan liuottamalla 0,9 g NaCl: a 100 ml: aan vettä.

2. Sinkkisulfaatti, 50 g / l: 5 g sinkkisulfaattia (ZnSO4) liuotetaan veteen, tilavuus nostetaan 100 ml: aan.

3. Natriumhydroksidi, 0,3 mol / l: valmistettu liuottamalla 1,2 g NaOH: ta 100 ml: aan vettä, pitoisuus tarkistetaan titraamalla (sen pitäisi olla 0,3 n).

4. Orthotolidiini, 1% liuos: 1 g lääkettä liuotetaan 100 ml: aan absoluuttista alkoholia. Liuos voidaan säilyttää jääkaapissa pullo, jossa on lasitulppa useita kuukausia. Kaupallisesti saatavilla oleva tuote voidaan puhdistaa uudelleenkiteyttämällä, johon se liuotetaan absoluuttiseen alkoholiin, lisätään vettä ja saostuneet kiteet imetään pois suodattimella ja kuivataan sitten kalsiumkloridilla.

5. Asetaattipuskuriliuos, pH 4,8, sekoita 4 osaa 0,25 n etikkahappoa (tarkista titrauksella) ja 6 osaa 0,25 n natriumasetaattia (sisältää 34 g CH3COONa X ЗН2О 1 litraa).

6. Glukoosioksidaasi on kuiva valmiste, jonka aktiivisuus on 3000 yksikköä / mg tai enemmän.

7. piparjuuriperoksidaasi. 1 mg liuotetaan 5 ml: aan asetaattipuskuria, se voidaan säilyttää jääkaapissa useita päiviä.

8. Työreagenssi: liuotetaan 2 mg glukoosioksidaasia ja 1 mg peroksidaasia 80 ml: aan asetaattipuskuria, lisätään 1 ml 1-prosenttista ortotolueenidiliuosta, sekoitetaan ja lisätään tilavuus 100 ml: aan puskuriliuoksella. Työreagenssin on oltava läpinäkyvä, väritön tai heikko vihreä sävy, jolloin se on stabiili kylmässä säilytettäessä. Jos väri on voimakasta tai muutaman tunnin kuluttua valmistuksesta, sakka alkaa laskea, mikä tarkoittaa, että ortotoluidiini ei ole riittävän puhdas ja se on kiteytettävä uudelleen.

9. Kalibrointi glukoosiliuokset. Glukoosi esikuivataan 37 ° C: ssa ja varastoidaan eksikaattoriin. Ensin valmistetaan emäksinen liuos, jonka konsentraatio on 50 mmol / l ja johon 180 mg ainetta liuotetaan 20 ml: aan kyllästettyä liuosta (noin 0,3%) bentsoehappoa. Tästä ratkaisusta valmistetaan 3 kalvon sisältämät työkalibrointiliuokset; 6; 9; 12; 15; 18 ja 21 mmol / l, joista ne ottavat 0,6; 1,2; 1,8; 2,4; 3; 3,6 ja 4,2 ml emäksistä liuosta ja saatetaan kyllästetty bentsoehapon liuos tilavuuteen 10 ml. Nämä liuokset sisältävät glukoosia samoissa pitoisuuksissa kuin veressä, mikä helpottaa laskutoimituksia kalibroinnin aikana.

Glukoosimäärityksen edistyminen glukoosioksidaasimenetelmällä

Sentrifugiputkissa lisätään 1,1 ml natriumkloridiliuosta, 0,4 ml sinkkisulfaattiliuosta ja 0,4 ml 0,3 n NaOH-liuosta, sekoitetaan; samanaikaisesti muodostuu hyvin ohut sinkkihydroksidigeeli, 0,1 ml verta tai kalibrointiliuosta vapautuu siihen, sekoitetaan uudelleen ja sentrifugoidaan 10 minuutin kuluttua nopeudella 3000 rpm 10 minuutin ajan.

1 ml: aan supernatanttia lisätään 3 ml työreagenssia ja sekoitetaan varovasti.

Väri alkaa vähitellen kehittyä, joka normaalissa huonelämpötilassa saavuttaa maksimiarvon 13-15 minuutissa ja alenee sitten vähitellen. Fotometrisesti aina saman ajanjakson jälkeen, kun työreagenssi on lisätty kyvetteihin, joiden optisen reitin pituus on 1 senttimetri punaisen valon suodattimella (aallonpituus 625 nm) joutokokemusta vastaan, joka asetetaan samanaikaisesti työnäytteiden kanssa, mutta veren sijasta otetaan fysiologinen natriumkloridiliuos.

Kalibrointikäyrää valmisteltaessa otetaan 0,1 ml sopivaa kalibrointiliuosta verinäytteiden sijaan.

Glukoosin laskeminen voidaan suorittaa suhteellisuussääntöjen tai kalibrointisuunnitelman mukaisesti, jotta voidaan rakentaa glukoosipitoisuus (mmol / l) yhdelle akselille ja ekstinktioarvo on toisaalta.

Huomautuksia glukoosin määritysmenetelmästä glukoosioksidaasimenetelmällä

1. Voit ensin vapauttaa veren pipetistä natriumkloridin isotoniseen liuokseen ja lisätä sitten sinkkisulfaatin ja NaOH: n liuoksia.

2. Kun järjestelmällistä työtä tehdään, kalibrointisuunnitelmaa ei tarvitse jatkuvasti rakentaa kaikille pisteille, riittää, että tyhjä näyte ja 2-3 pistettä käsitellään 3-9 mmol / l päivässä, ja rakentaa täydellinen kalibrointisuunnitelma vain reagenssien vaihtamisen tai menettelyn säätämisen yhteydessä.

Glukoosioksidaasimenetelmä glukoosin määrittämiseksi

Glukoosioksidaasimenetelmää käytetään glukoosipitoisuuden määrittämiseen yksinomaan erilaisissa kehon nesteissä. Tämän testin etuna on sen tarkkuus. Diagnostiikka, toisin kuin nopeat menetelmät, sallii puhtaan glukoosin määrän paljastamisen ilman fruktoosia ja muita sokereita. Tämän reaktion periaate on värittää liuos, joka tapahtuu hapettimien vuorovaikutuksen seurauksena spesifisten väriaineiden kanssa. Tutkimustulosten arviointi suoritetaan käyttämällä kolorimetriamenetelmää ja vertailua standardiliuoksiin.

Milloin glukoosioksidaasimenetelmä on määrätty?

Tätä testiä käytetään havaitsemaan heikentynyt sokeritoleranssi ja pre- diabeteksen kehittyminen sekä taudin korkeus. Mutta analyysiä käytetään harvoin tällaisiin tarkoituksiin, tämä johtuu sen korkeista kustannuksista ja pitkästä odottamisesta. Useimmiten glukoosin määrittämistä veressä ja virtsassa käytetään tätä menetelmää käyttäen sellaisten sairauksien, kuten:

laktoosi-intoleranssin oireyhtymä;
fruktoosi-intoleranssi;
fruktoosin vapautuminen kehon nesteillä;
lisääntynyt pentoosipitoisuus virtsassa.

Glukoosioksidaasitestin kiistaton etu on sen tarkkuus.

Mikä on tämän menetelmän perusta?

Veren glukoosipitoisuuden määrittämiseksi on olemassa erilaisia menetelmiä, mutta glukoosioksidaasi on tarkin. Alempi rivi on, että sokerin ja ilman hapen välinen vuorovaikutus hapettaa reagenssin. Vetyperoksidi vapautuu liuokseen. Tämä aine on vuorovaikutuksessa ortotolueeniinin kanssa muodostaen värillisen yhdisteen. Tämän reaktion käyttäytymistä varten tarvitaan erityisiä entsyymejä. Glukoosioksidaasin on oltava läsnä hapetusreaktiossa ja peroksidaasi nesteen värjäyksessä. Liuoksen värin voimakkuus riippuu glukoosipitoisuudesta ja on voimakkainta sen korkean sisällön kanssa.

Glukoosioksidaasimenetelmän olemus glukoosin määrittämiseksi

Tuloksen arviointi tapahtuu käyttämällä fotometrian kvantitatiivista menetelmää samalla aikavälillä. Varmista, että käytät kalibrointiliuosta, joka sisältää tietyn ilmoitetun sokerimäärän, ja siitä lähtien voit arvioida glukoosipitoisuuden kehon nesteissä, usein veressä.

Miten analyysi tehdään?

Materiaali otetaan potilaasta tyhjään vatsaan. Testissä, jossa käytetään laskimoveriä 5 ml: n määränä. Diagnoosin aattona potilaalle näytetään tiukka ruokavalio. Näin voidaan arvioida tuloksen luotettavuutta ja sulkea pois mahdolliset analyysivirheet. 2 päivää ennen veren vetäytymistä potilaan täytyy luopua juomista ja tupakoinnista. On myös tarpeen rajoittaa liian makeiden ruokien nauttimista ja, jos mahdollista, välttää stressaavia tilanteita.

Useimmiten tämä menetelmä glukoosipitoisuuden määrittämiseksi suoritetaan sentrifugointimenetelmällä, jota käytetään muotoiltujen elementtien erottamiseen. Sokerin määrä määritetään plasmassa. Kun kaikki tarvittavat reagenssit lisätään siihen, väri havaitaan 20 minuutin kuluttua, jos testi suoritetaan huoneenlämpötilassa. Glukoosipitoisuuden laskeminen suoritetaan kalibrointisuunnitelman mukaisesti tai käyttämällä osien sääntöä.

Reagenssit tutkimukseen

Sokerin määrittämiseksi on kätevintä käyttää nopeita menetelmiä veren glukoosin määrittämiseksi. Tämä johtuu helppokäyttöisyydestä ja nopeista tuloksista. Lisäksi potilaan ei tarvitse mennä laboratorioon tai sairaalaan. Toisin kuin glukoosioksidaasitestissä, tällainen diagnoosi on epäluotettava. Koska se ei erota glukoosia muista sokereista ja määrittää niiden pitoisuuden yhdessä.

Glukoosioksidaasireaktion perustana on natriumkloridin 9% liuos ja sinkkisulfaatti 50%. Ne lisätään veren sentrifugoinnin vaiheessa. Lisäksi käytä puskuriliuosta, jossa on etikkahappoa ja natriumasetaattia. Titrausmenetelmä määrittää sen pH-arvon 4,8. Tämän jälkeen lisätään glukoosioksidaasia, joka aiheuttaa vetyperoksidia ja peroksidaasia, joka osallistuu liuoksen värjäykseen haluttuun pitoisuuteen tarkan tuloksen saamiseksi.

Standardit analyysin aikana

Sokerin määrä mitataan erikoisyksiköissä - millimoolia litraa kohti.

Glukoosioksidaasin verikokeet on tehtävä tyhjään vatsaan, ja tähän käytetään plasmaa tai seerumia. Sekä naisten että miesten aikuisten määrä on 3,3–5,5. Alle 15-vuotiaille lapsille tämä luku on hieman alhaisempi ja vaihtelee välillä 3,2–5,3. Vastasyntyneillä verensokeri on 1,7–4,2. Suorituskyvyn lisääntyminen havaitaan diabetesta sairastavan tai glukoositoleranssin vastaisen potilaan kehityksessä. Tämä tila on prediabetes, ja jos sitä ei hoideta ajoissa, niin pian se johtaa tämän vakavan patologian kehittymiseen.

TYÖN numero 1. GLUKOOSIN MÄÄRÄINEN MÄÄRITTÄMINEN VERASSA. ENSYMATTINEN (GLUCOSOOXIDAL) MENETELMÄ

PERUSTELUT TYÖN TOTEUTTAMISEKSI. Glukoosin määrittäminen kokoveressä tai plasmassa suoritetaan kussakin potilaassa, jotta voidaan arvioida hiilihydraatin aineenvaihdunnan tila ja diagnosoida patologia (hyperglykemia, hypoglykemia). Verensokeripitoisuuden määrittämiseksi käytetään entsymaattista menetelmää, joka perustuu glukoosin hapettumiseen glukoosihapoksi hapen läsnä ollessa. Menetelmä on erittäin spesifinen D-glukoosin määrittämiseksi muiden pelkistävien aineiden mukana, jotka sisältyvät kudosuutteisiin ja biologisiin nesteisiin.

MENETELMÄN PERIAATE. Glukoosioksidaasi on monimutkainen entsyymi, joka sisältää FAD: n proteesiryhmänä. Kun glukoosi hapetetaan glukoosioksidaasilla, kaksi vetyatomia irrotetaan glukoosimolekyylin ensimmäisestä hiiliatomista. Lisäksi nämä kaksi vetyatomia siirretään FAD: iin, muodostuu FADH₂. Jälkimmäinen siirtää vetyatomeja molekyyliseen happeen muodostaen H₂oi₂. Sitten H₂oi₂ peroksidaasientsyymi pilkkoo sen veteen ja atomihapoksi, joka hapettaa kromogeenin (väriaineen), joka muuttuu värjäytynyttä hapettumisen aikana.

Glukoosioksidaasimenetelmä

Nykyisin käytetään eniten glukoosioksidaasin entsyymin käyttöön perustuvia menetelmiä. Menetelmä perustuu seuraavaan reaktioon:

Glukoosioksidaasi katalysoi kahden vetyatomin siirtymistä glukoosin ensimmäisestä hiiliatomista nestemäiseen reagenssiin liuotettuun happeen. Reaktion aikana vetyperoksidi muodostuu ekvimolaarisina määrinä. eli muodostuneen vetyperoksidin pitoisuus on täsmälleen sama kuin määritetty glukoosipitoisuus. Näin ollen glukoosioksidaasireaktion käyttö muutti glukoosikonsentraation määrittämisen ongelmaksi vetyperoksidin pitoisuuden määrittämisen ongelmaksi, joka, kuten alla esitetään, on paljon yksinkertaisempi kuin ensimmäinen. Ja tässä on useita menetelmiä, joita käytetään nykyään laajalti laboratoriokäytännössä (ks. Kaavio).

Edellä mainituista rekisteröintimenetelmistä yleisimmin käytetty fotometrinen biokemiallinen menetelmä, jossa peroksidaasin entsyymin vaikutuksesta vetyperoksidimolekyylit jakautuivat aktiivisen happimuodon muodostumiseen - superoksidianioniradikaali - O₂ -, joka puolestaan hapettaa kromogeenin, mikä johtaa merkittävään muutokseen kromogeenin absorptiospektrissä.

Tämän menetelmän suuri suosio glukoosin määrittämiseksi johtuu sen korkeasta spesifisyydestä ja helppokäyttöisyydestä. Menetelmä voidaan toteuttaa käyttämällä tavanomaista fotometriä ja käyttämällä automaattisia biokemiallisia autoalysaattoreita.

Glukoosioksidaasimenetelmä tunnistetaan tänään yhtenä tarkimmista kvantitatiivisista menetelmistä glukoosin määrittämiseksi. Biologisena materiaalina käytetään seerumina ja kokoverinä. Jälkimmäisen kanssa työskennellessä on otettava huomioon, että kun kapillaariveri otetaan, seerumin (plasman) osuus riippuu hematokriittiarvosta, joka voi vaikuttaa haitallisesti tuloksen tarkkuuteen. Siksi määritettäessä glukoosia edellä kuvatulla menetelmällä on edullista käyttää potilaan seerumia.

Päätepisteen fotometrisen menetelmän ohella useita vuosia sitten ilmestyivät sarjat, joissa toteutettiin kineettinen fotometrinen menetelmä. Menetelmän ydin on se, että tietty suhde glukoosioksidaasin ja peroksidaasin aktiivisuuteen värillisen yhdisteen muodostumisnopeus jonkin ajan kuluttua näytteen lisäämisestä työliuokseen on verrannollinen näytteen glukoosipitoisuuteen. Tämän menetelmän etuna on, että tulos ei riipu muiden yhdisteiden läsnäolosta näytteessä, koska jälkimmäisen absorptio on stabiili ajan myötä. Tämä menetelmä edellyttää kineettistä fotometriä, puoliautomaattisia analysaattoreita tai automaattisia biokemiallisia analysaattoreita. Glukoosipitoisuuden mittaus kokoverestä suoritetaan sopivasti käyttämällä instrumentteja, joiden toiminta perustuu amperometriseen mittausperiaatteeseen käyttäen erityisiä entsyymiantureita. Vetyperoksidi on erittäin epästabiili kemiallinen yhdiste, ja se voi toimia varautuneiden hiukkasten lähteenä. Tätä käytetään kalvotyypin entsyymiantureissa tai kannettavien glukometrien sähkökemiallisissa elementeissä.

Lopuksi meidän pitäisi mainita glukoosioksidaasimenetelmän haitat. Tuloksena oleva vetyperoksidi- ja superoksidianioniradikaali voi hapettaa ei ainoastaan kromogeeniä, vaan myös muita biologisessa nesteessä olevia aineita: askorbiinihappoa, virtsahappoa, bilirubiinia. Samanaikaisesti kromogeenin hapettumiseen osallistuvan peroksidin osuus pienenee, mikä johtaa glukoosituloksen aliarviointiin. Tämä menetelmä on yleensä lineaarinen, jopa 20-30 mmol / l glukoosia.

Verensokerin kvantitatiivinen määrittäminen glukoosioksidaasimenetelmällä

Menetelmän periaate. Menetelmä perustuu glukoosioksidaasin entsyymin vaikutuksen spesifisyyteen. Tämä entsyymi hapettaa glukoosia molekyylin hapen läsnä ollessa muodostaen glukonolaktonia, joka spontaanisti hydrolysoituu glukonihapoksi. Glukoosioksidaasi hapettaa glukoosia muodostamaan vetyperoksidia (H₂oi₂), joka peroksidaasin vaikutuksesta reagoi 4-aminoantipyriinin ja fenolin kanssa. Tuloksena on vaaleanpunainen väriyhdiste, jonka optinen tiheys 510 nm: ssä on verrannollinen näytteen glukoosipitoisuuteen.

2 N₂oi₂ + 4-aminoantipyriini + fenoli → kinoni-imiini + 4H₂oi

laitteet: KFK, sentrifugi, termostaatti, jalustat, koeputket, pipetit, biologinen materiaali, työliuoksen sisältämät reagenssit.

koenäyte, ml

standardinäyte, ml

yksi testi (N₂O), ml

Kalibrointi glukoosiliuos (vakio)

Putkia inkuboidaan termostaatissa 37 ° C: ssa 15 minuuttia, sitten kolorimetroidaan vihreällä suodattimella vihreässä suodattimessa kyvetissä, joiden kerrospaksuus on 5 mm aihiota vastaan (H₂O). Vaaleanpunainen väri on stabiili 1 tunnin ajan inkuboinnin jälkeen.

laskelma glukoosipitoisuus:

C = x C standardi, missä

C on kokeellisen näytteen glukoosipitoisuus, mol / l;

Eop on näytteen optinen tiheys;

Est on kalibrointinäytteen optinen tiheys;

С standardipitoisuus kalibrointiliuoksessa, mol / l.

Normaalit arvot:  vastasyntyneet - 2,8-4,4 mmol / l

 lapset - 3,9 -5,8 mmol / l

 aikuiset - 3,9 - 6,2 mmol / l

Hypoglykemia (HGH). Verensokerin kasvu johtuu monista syistä, joiden mukaan hyperglykemiaa on kaksi.

1. Insular - liittyy riittämättömään pitoisuuteen insuliinirungossa tai sen tehottomuuden vuoksi.

2. Extrainsular (extrainsular) - ei riipu insuliinin vaikutuksesta.

Seuraavat prosessit ovat merkittävimpiä HGH: n muodostumisessa: tehostettu glykogeenin hajoaminen; lisääntynyt neoglukogeneesi; glykogeenisynteesin estäminen; hormonaalisen insuliiniantagonistin vaikutuksesta kudosten glukoosin käytön väheneminen: somatotropiini, glukortikoidit, tyroksiini, tyrotropiini.

Ruokavalion hyperglykemiaa havaitaan verensokerin liiallisella tarjonnalla (esimerkiksi hyperglykemia sokerikuormituksessa). "Maksan" hyperglykemia esiintyy maksan diffuusiovaurioissa.

Pysyvä ja vakava hyperglykemia liittyy useimmiten diabetes mellitukseen. On tapana eristää insuliinista riippuva diabetes mellitus ja ei-insuliiniriippuva diabetes tai vastaavasti tyypin I diabetes ja tyypin II diabetes. I-tyypin diabeteksen muodostuminen liittyy pääasiassa insuliinin synteesin heikentymiseen ja vaihtoon.

Toinen ryhmä hyperglykemiaa liittyy pääasiassa hormonitoimintaa tuottavien endokriinisten rauhasten hyperfunktioon - insuliiniantagonisteihin. Sitä havaitaan sellaisissa sairauksissa, kuten oireyhtymä ja Cushingin tauti, akromegalia, tyrotoksikoosi, feokromosytoma, glukogenoma. Veren glukoosipitoisuudet kasvavat myös tietyissä maksasairauksissa (erityisesti 10–30%: lla maksakirroosista kärsivistä potilaista), hemokromatoosista (maksan kirroosi pigmentoituneesta, pronss diabeteksesta).

Hypoglykemia (HGP) - veren glukoosipitoisuuden väheneminen - useimmiten liittyy veren absoluuttiseen tai suhteelliseen lisääntymiseen. Vnepankreaticheskim hypoglykemia havaittu seurauksena epätasapainossa laajuus prosessien glykogenolyysiä ja glukoneogeneesiä maksassa aikana akuutti ja krooninen hepatiitti, kirroosi, akuutti ja subakuutti maksasairaus, alkoholimyrkytys, myrkytys arseenin, fosfori, pitkittyneen mekaaninen keltaisuus, kongestiivinen maksa, primaarinen tai metastaattinen maksasyöpä. Veren glukoosipitoisuuden vähenemistä havaitaan usein potilailla, jotka kärsivät ruokatorven syöpään ja muihin pahanlaatuisiin kasvaimiin ekstrapancreatic-lokalisoinnissa (fibroma, fibrosarkooma, neuroma), samoin kuin indomoituva oksentelu, anoreksia, maksan diabetes, uremia, runsas imetys ja glukosuria raskaana olevilla naisilla.

Hypoglykemia voi olla keskeistä alkuperää henkisen trauman, enkefaliitin, subarahhnoidisen verenvuodon, aivokasvain vuoksi.

1. Perinnölliset hiilihydraattihäiriöt.

2. Millaisia hyperglukoosia tunnetaan sinulle?

3. Mitkä ovat patologisen hyperglukemian syyt?

4. Mikä on insuliiniriippuvaisen diabeteksen syy?

5. Mitkä ovat perinnöllisten sairauksien biokemialliset syyt: a) glykogenoosi? b) aglykogenoosi? c) fruktosemia? d) galaktosemia?

6. Mitkä ovat biokemialliset muutokset hiilihydraatin aineenvaihdunnassa paastoamisen aikana?

7. Glukoositoleranssin määritysmenetelmän periaate.

Glukoosioksidaasi- ja heksokinaasimenetelmät seerumin glukoosipitoisuuden määrittämiseksi veressä

Tarkka diagnoosi, lääkehoito edellyttävät useita laboratoriokokeita.

Seerumin glukoosin määritysmenetelmä on tärkein keino havaita hyper- ja hypoglykemia diabetes mellituspotilailla.

Menetelmä mahdollistaa lääkehoidon aineenvaihdunnan häiriöiden säätämisen. Diagnostiset glukoosipitoisuudet voidaan määrittää myös kokoverestä ja sen plasmasta.

Menetelmät verensokerin määrittämiseksi

Menetelmät glukoosin määrän määrittämiseksi veressä kehittyivät paljon.

Joitakin niistä (redometrinen, kolorimetrinen) ei käytännössä käytetä suuren toksisuuden ja alhaisen tarkkuuden vuoksi.

Yleisimmin käytetyt entsyymitutkimukset. Glukoosioksidaasimenetelmä on värireaktion menetelmä, joka tapahtuu, kun hiilihydraatteja kuumennetaan. Heksokinaasi määrittää veren aktiivisuuden heksokinaasissa.

Glukoosioksidaasimenetelmä

Glukoosioksidaasimenetelmä verensokerin määrittämiseksi perustuu sen hapetusreaktioon entsyymin vaikutuksen alaisena. Tämä muodostaa vetyperoksidin, se värjää aineen kromogeenin, jonka pitoisuus määrittää glukoosin määrän.

Glukoosioksidaasimenetelmää käytetään:

perinnöllinen fruktoosi-intoleranssi;
pentosuria;
laktoosi-intoleranssi.

Tutkimuksen haittana on, että vetyperoksidi kykenee hapettamaan sekä kromogeenin että askorbiinin, virtsahapon ja veren sisältämän bilirubiinin. Laske glukoosi-fotometrisen menetelmän määrä, värjäyksen voimakkuutta verrataan kalibrointikäyrään.

Laboratorio-olosuhteissa aineen määrä voidaan määrittää:

laskimoon. Käytetään automaattisia analysaattoreita;
kapillaariveressä. Aita tehdään sormesta.

Sähkökemiallinen menetelmä käsittää glukoosioksidaasia sisältävien elektrodien käytön. Määritetään muodostuneen vetyperoksidin määrä tai hapetusprosessin aikana kulutetun hapen jäljellä oleva määrä.

Heksokinaasimenetelmä

Aine on tärkein glukoosi-aineenvaihdunnan entsyymi, joka rajoittaa prosessin nopeutta soluissa.

Laboratorio-olosuhteissa heksokinaasin vaikutuksesta glukoosi fosforyloidaan adenosiinitrifosfaatilla.

Reaktion tuloksena muodostuu orgaanisia molekyylejä, joiden määrä määräytyy ultraviolettivyöhykkeen valon absorptiotason mukaan. Liian nopea positiivinen heksokinaasireaktio voi myös olla merkki pahanlaatuisten kasvainten esiintymisestä.

Analyysin valmistelu

Veren seerumin glukoosikokeet on määrätty:

Ennen analyysiä sinun on noudatettava useita ehtoja, jotta tulokset ovat mahdollisimman luotettavia:

tutkimusta tehdään tyhjään vatsaan. Aamulla otettu materiaali;
pari päivää ennen diagnoosia on välttämätöntä välttää raskasta fyysistä rasitusta, stressiä;
Päivittäisessä ruokavaliossa potilaan on oltava vähintään 150 grammaa hiilihydraatteja. Puutteella glukoosin taso kasvaa ja se laskee hitaasti, mikä vääristää datan analysointia;
päivää ennen diagnoosia ei voi tupakoida ja juoda alkoholijuomia;
on mahdotonta suorittaa tutkimusta raskaiden operaatioiden, synnytyksen, tulehdusten läsnä ollessa. Vasta-aiheet maksakirroosin analysoinnissa, mahalaukun sairauksien pahenemisessa, kasvaimen prosesseissa;
pari päivää ennen tutkimusta ei pitäisi suorittaa fysioterapeuttisia menetelmiä, ottaa suun kautta otettavia ehkäisyvalmisteita, diureettisia lääkkeitä, psykotrooppisia lääkkeitä, kofeiinia.

Analyysi voi antaa vääriä positiivisia tuloksia hypokalemiassa ja endokriinisairauksissa (Cushingin oireyhtymä, tyrotoksikoosi).

Glukoosin normit veren seerumissa iän mukaan

Normaalit indikaattorit riippuvat iästä:

nenäveri voi sisältää 2,5 - 5,3 mmol / l;
ennenaikaisilla vauvoilla - 1,1 - 3 mmol / l;
ensimmäisen elämän päivän lapset - 2,22–3,33;
2,7 - 4,4-vuotiaana;
yli 6-vuotiailla lapsilla - 3,3-5,5 mmol / l;
aikuisilla jopa 60 vuotta - 4,4: stä 6,3: een;
vanhuksilla - 4,6 - 6,1 mmol / l.

Hypoglykemia aikuisilla diagnosoidaan glukoosiarvojen ollessa alle 3,3 mmol / l ja hyperglykemia - yli 6,1 mmol / l.

Glukoosioksidaasimenetelmä glukoosin määrittämiseksi plasmassa

Olemme iloisia voidessamme toivottaa sinut tervetulleeksi sivustoon www.unimedao.ru!

Kiitos vastauksesta kysymykseemme.

19.11.2009

Gerasimenko V.A, Ph.D., Kurilyak O.A., Ph.D.

Uutisen A / O Unimed -lehden arkistosta

Glukoosipitoisuuden määrittäminen veressä on yksi useimmiten suoritetuista biokemiallisista tutkimuksista QDL: ssä. Syynä testin poikkeukselliseen suosioon liittyy diabeteksen suuri esiintyvyys. Tämä testi suoritetaan sekä sairaalassa että avohoidossa. Diabeteksen potilaat joutuvat tutkimaan veren glukoosin määrää kotona, koska ilman näitä tietoja on vaikea mukauttaa ruokavaliotaan, liikuntaa, insuliinin ja muiden diabeteslääkkeiden käyttöä. Testin poikkeuksellinen merkitys ja suoritetut tutkimukset ovat kannustaneet kehittäjiä luomaan erilaisia tyyppisiä laitteita ja menetelmiä veren glukoosipitoisuuden määrittämiseksi.

Tällä hetkellä on olemassa monia menetelmiä glukoosin määrittämiseksi. Ne voidaan luokitella seuraavasti.

Menetelmät glukoosin määrittämiseksi seerumissa

- fotometrinen loppupiste

- heijastava fotometria - kuiva kemia

Kaksi ensimmäistä menetelmää ovat erittäin hankalia, myrkyllisiä ja niillä on alhainen tarkkuus, joten emme asu niihin.

Glukoosioksidaasimenetelmä

Nykyisin käytetään eniten glukoosioksidaasin entsyymin käyttöön perustuvia menetelmiä. Menetelmä perustuu seuraavaan reaktioon:

Kuviossa 1 Kuviot 1 ja 2 esittävät työliuoksen spektrit ennen ja jälkeen tavallisen glukoosiliuoksen lisäämisen. Reaktioseoksen maksimaalinen absorptio (reagenssi + glukoosi) on alueella 500 nm. Näin ollen lopullisen reaktion optisen tiheyden muutos aallonpituudella 480-520 nm on verrannollinen näytteessä olevaan glukoosipitoisuuteen.

Tämän menetelmän suuri suosio glukoosin määrittämiseksi johtuu sen korkeasta spesifisyydestä ja helppokäyttöisyydestä. Menetelmä voidaan toteuttaa käyttämällä tavanomaista fotometriä (parempi kuin erikoistunut biokemiallinen fotometri, kuten Mikrolab 540) tai automaattisten biokemiallisten autoalysaattoreiden avulla.

Päätepisteen fotometrisen menetelmän ohella useita vuosia sitten ilmestyivät sarjat, joissa toteutettiin kineettinen fotometrinen menetelmä. Menetelmän ydin on se, että tietty suhde glukoosioksidaasin ja peroksidaasin aktiivisuuteen värillisen yhdisteen muodostumisnopeus jonkin ajan kuluttua näytteen lisäämisestä työliuokseen on verrannollinen näytteen glukoosipitoisuuteen. Tämän menetelmän etuna on, että tulos ei riipu muiden yhdisteiden läsnäolosta näytteessä, koska jälkimmäisen absorptio on stabiili ajan myötä. Tämä menetelmä edellyttää kineettistä fotometriä, kuten Stat Fax 1904+, Stat Fax 3300, puoliautomaattisia analysaattoreita, kuten Clima 15, tai automaattisia biokemiallisia analysaattoreita. Glukoosipitoisuuden mittaus kokoverestä suoritetaan sopivasti käyttämällä instrumentteja, joiden toiminta perustuu amperometriseen mittausperiaatteeseen käyttäen erityisiä entsyymiantureita. Vetyperoksidi on erittäin epästabiili kemiallinen yhdiste ja se voi toimia varautuneiden hiukkasten lähteenä. Tätä käytetään kalvotyypin entsyymiantureissa tai kannettavien glukometrien sähkökemiallisissa elementeissä.

Kokoveren näyte (tavallisesti 20 μl) laimennetaan järjestelmän puskuriliuokseen (punaiset verisolut tuhoutuvat) ja syötetään sitten linjan läpi virtauskennoon. Glukoosi hapetetaan kalvolla sijaitsevan glukoosioksidaasin entsyymin vaikutuksesta. Tuloksena oleva vetyperoksidi diffundoituu kalvon läpi ja hapetetaan edelleen katalyyttisessä reaktiossa platinan vaikutuksesta. Vetyperoksidin diffuusio platinan pinnalle muodostaa virran, joka on verrannollinen molekyylien H lukumäärään₂oi₂. Näin saatu signaali käsitellään laitteessa vastaavalla jännitearvolla. Tämä mitattu arvo on verrannollinen näytteen glukoosipitoisuuteen.

Esimerkkinä edellä kuvatuista menetelmistä voidaan mainita Biosenin glukoosianalysaattorit (Saksa). Nämä laitteet ovat käteviä käytettäväksi paitsi sairaaloissa myös poliklinikoissa, joissa glukoositestaus tehdään pääasiassa kapillaariverestä.

Tärkeä askel kliinisten laboratorioiden diagnostisten menetelmien kehittämisessä oli "kuivan kemian" syntyminen. Luonnollisesti yksi tämän tekniikan ensimmäisistä sovelluksista oli potilaan veren glukoosin määrittäminen. Ensimmäiset laitteet olivat tavanomaisissa laboratorio-tutkimusmenetelmissä huomattavasti huonommat. Ajan mittaan useat yritykset pystyivät kuitenkin kehittämään tällaisia diagnostisia nauhoja ja heijastavia fotometrejä, jotka antoivat erittäin korkean analyysin tarkkuuden. One Touch -glukometrit ja Life Scan (USA)-testiliuskat ovat laajalti suosittuja kaikkialla maailmassa, ja ne yhdistävät onnistuneesti kvantitatiivisen entsymaattisen menetelmän analyyttisen tarkkuuden "kuivan kemian" nopeuteen ja yksinkertaisuuteen.

One Touch -verensokerimittarit on suunniteltu mittaamaan nopeasti ja tarkasti glukoosipitoisuudet kokoveressä. One Touch-testiliuska sisältää kaikki tarvittavat kemialliset komponentit kaksivaiheiselle glukoosioksidaasimenetelmälle, mukaan lukien glukoosioksidaasin ja peroksidaasin entsyymit, jotka adsorboituvat ainutlaatuiseen huokoiseen hydrofiiliseen kalvoon. Reaktion tulos on värillisen kompleksin muodostuminen. Kehitetyn värin voimakkuus tallennetaan heijastavalla miniphotometrillä.

Membraani-testiliuska One Touch muistuttaa sienellä mikroskooppisia huokosia ja suorittaa kolminkertaisen toiminnon. Se toimii: 1) säiliönä, keräämällä vaaditun veren määrän, 2) suodattimena, estämällä kiinteän solumateriaalin (erytrosyytit, leukosyytit jne.), 3) tasaisena optisena pintana, jolla heijastunut valo mitataan. Viimeksi mainittu toiminto on erityisen tärkeä laitteen toiminnan kannalta. Sen avulla voidaan lukea nauhan alaosa, kun taas veri pysyy testiliuskan yläosassa. Niinpä ei ole tarpeen pestä (blottaa) verta testiliuskan pinnalta.

Lisäksi kalvolla on hydrofiilisiä ominaisuuksia, joiden vuoksi veripisara "houkuttelee" koeliuskan pintaan, kun se koskettaa.

One Touch -laitteessa on kaksi erityistä LEDiä. Kehitetyn värin käsittely testiliuskalla on seuraava. Heti kun testiliuska asetetaan laitteeseen, tapahtuu nolla-lukema. Tällä hetkellä näytöllä näemme: “WAIT”. Kun testiliuskaan levitetään veripisara, veriplasma välittömästi kohoaa kalvon, kun taas erytrosyytit ja ylimääräinen plasma jäävät kalvon pinnalle. Veripisaran täydellisen imeytymisen jälkeen värjäytyy välittömästi. Laite tallentaa heijastuksen suuruuden muutoksen ja käynnistää ajastimen automaattisesti. 45 sekunnin kuluttua kemiallinen reaktio päättyy, valon heijastuksen tulos käsitellään. Värillinen reaktiotuote absorboi ensimmäisen LEDin lähettämän valon. Verisolut ja ylimääräinen plasma absorboivat myös diodin lähettämän valon. Taustaheijastuksen korjaamiseksi toinen lukema suoritetaan toisella LED: llä eri aallonpituudella. Ensimmäisestä ja toisesta LEDistä tulevien signaalien välinen ero sisältää tietoa kromogeenin valon absorptiosta. Kromogeenista vastaanotettu signaali glukoosipitoisuuden arvioimiseksi korreloi erityisen kalibroinnin kanssa. Kaikki One Touch -laitteet kalibroidaan käyttäen vertailumenetelmää laboratorion glukoosianalysaattorissa. Tällä menetelmällä saadaan tavallinen kalibrointikäyrä. On huomattava, että on melko vaikeaa määrittää testiliuskojen tuotanto, joka olisi ehdottomasti sama kemiallisesti reagenssien erittäin alhaisen pitoisuuden vuoksi. Tämän ongelman ratkaisemiseksi käytetään tavallista kalibrointikäyrää, joka koostuu 16 kalibrointilinjasta. Laadunvalvonta suoritetaan välittömästi testiliuskojen valmistuksen jälkeen, mikä mahdollistaa sen, mitkä kalibrointilinjoista (1-16) voidaan soveltaa tähän testiliuskaan. Tämä on ns. Koodinumero, joka on kiinnitetty koeliuskan pakkaukseen. Nämä 16 kalibrointilinjaa on ohjelmoitu myös mikroprosessoriin. Optimaalisten tulosten saamiseksi testiliuskojen pakkauksessa oleva koodinumero asetetaan laitteeseen koodipainikkeella. Siten laitteen väärin asennettu koodi voi aiheuttaa mittausvirheen.

Koska One Touch -laitteet ovat tulleet markkinoille, Venäjän, Amerikan ja Euroopan laboratorioissa on kulunut paljon kliinisiä tutkimuksia. Yksi näistä tutkimuksista tehtiin Venäjän lääketieteellisen akatemian endokrinologisen tieteellisen keskuksen toimesta Venäjän lääketieteellisen laboratorion diagnostiikan yhdistyksen pyynnöstä. Keskusasiantuntijat suorittivat vertailuanalyysin kahdesta verensokeritason mittausmenetelmästä. One Touch -menetelmässä saatuja tuloksia verrattiin Spectrum II: n biokemiallisella analysaattorilla (Abbott Laboratories, USA) saatuun dataan, joka toteuttaa heksokinaasimenetelmän glukoosin määrittämiseksi. 190 verinäytettä 95 potilaasta tutkittiin. Tulosten korrelaatiokerroin oli 0,98641. One Touch -mittarin normaalien ja patologisten vaihteluvälien vaihtelukerroin ei ylitä 2,5%.

Venäjän lääketieteen akatemian endokrinologisen tutkimuskeskuksen virallinen raportti sanoi: ”One Touch -laitteilla on suuri tarkkuus ja tarkkuus sekä laaja valikoima mittauksia. Niitä voidaan käyttää diagnosoimaan diabeteksen hätätilanteita, mukaan lukien pelastusryhmät, koska nämä laitteet eivät ole ainoastaan luotettavia, vaan myös tuottavat nopeasti tuloksia. "

Heksokinaasimenetelmä

Rekisteröinti suoritetaan aallonpituudella 340 nm NADH: n absorptiolla. Tämä menetelmä on erittäin spesifinen eikä reagoi muiden veren seerumin komponenttien kanssa. Heksokinaasimenetelmää pidetään referenssinä glukoosin määritykselle. Pääsääntöisesti se on lineaarinen 50 mmol / l: iin, mikä mahdollisti sen laajalti suositeltavan endokrinologisten osastojen klinikoille.

Kuvattujen glukoosin määritysmenetelmien moninaisuudesta QDL-työntekijät voivat itse päättää, mikä määritysmenetelmä ja mikä laite valita:

"Märkä" biokemian menetelmät, jotka toteutetaan automaattisilla biokemiallisilla analysaattoreilla, tarjoavat laboratorioiden tarpeet, joilla on suuri analyysivirta.
Biosen-tyyppiset glukoosianalysaattorit tarvitsevat operaattorilta vähäisiä ponnisteluja, koska ne ovat täysin automatisoituja ja riittävän tuottavia (nopeus 50 - 200 näytettä tunnissa).
Laboratoriot, joissa on pieni määrä tutkimuksia, sekä pikalaboratoriot, on erikoistunut biokemiallinen fotometri Mikrolab 540.
Apujoukkueille piilota ohje on täydellinen ratkaisu - veren glukoosimittarit kuten One Touch.

Näin ollen QDL: n tehtävä varmistaa paitsi nopea, myös erittäin tarkka glukoosimääritys on täysin ratkaistavissa.

Verensokeri, virtsa, neste

Verensokeri on tiukasti valvottu.

Veren glukoosipitoisuuden säätäminen tapahtuu hermovaikutusten ja hormonien avulla.

Hermosto

Veren glukoosipitoisuuden hermostosääntely ilmaistaan n.vaguksen positiivisella vaikutuksella insuliinin eritykseen ja inhiboiva vaikutus tähän sympaattisen inervaatioprosessin vaikutukseen. Lisäksi adrenaliinin vapautuminen veriin kohdistuu sympaattisesti.

Hormonaalinen säätely

Pääasialliset hormonaalisen säätelyn tekijät ovat glukagoni, adrenaliini, glukokortikoidit, somatotrooppinen hormoni ja toisaalta insuliini. Kaikki hormonit, paitsi insuliini, vaikuttavat maksaan, lisäävät glykemiaa.

Insuliini on ainoa kehon hormoni, jonka tavoitteena on alentaa veren glukoosipitoisuutta. Sen vaikutuksesta glukoosi imeytyy voimakkaasti lihaksista ja rasvakudoksesta.

Verensokeripitoisuuden lasku insuliinilla saavutetaan seuraavilla tavoilla:

glukoosin siirtyminen soluihin - GluT4-transporteriproteiinien aktivoituminen sytoplasmisessa membraanissa,
glukoosin osallistuminen glykolyysiin - glukokinaasin synteesin lisääntyminen, glukoosilukkoa kutsuttava entsyymi, muiden keskeisten glykolyysisentsyymien synteesin stimulointi - fosfofrukokranaasi, pyruvaattikinaasi,
lisääntynyt glykogeenisynteesi - glykogeenisyntaasin aktivointi ja sen synteesin stimulointi, mikä helpottaa glukoosin ylimäärän muuttumista glykogeeniksi,
pentoosifosfaattireitin aktivointi - glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasin ja 6-fosfoglukonaattidehydrogenaasin synteesin induktio, t
lisääntynyt lipogeneesi - glukoosin osallistuminen triasyyliglyserolien tai fosfolipidien synteesiin.

Monet kudokset ovat täysin epäherkkiä insuliinin vaikutuksesta, niitä kutsutaan insuliinista riippumattomiksi. Näitä ovat hermokudos, lasimainen elin, linssi, verkkokalvo, glomerulaariset munuaissolut, endoteelisolut, kivekset ja punasolut.

Glucagon nostaa verensokeria:

glykogeenin mobilisaation lisääminen glykogeenifosforylaasiaktivaation avulla, t
glukoneogeneesin stimulointi - pyruvaattikarboksylaasin, fosfoenolipyruvaattikarboksykinaasin, fruktoosi-1,6-difosfataasin entsyymien työn lisääminen.

Adrenaliini aiheuttaa hyperglykemiaa:

glykogeenin mobilisaation aktivointi - glykogeenifosforylaasin stimulointi,

Glukokortikoidit lisäävät veren glukoosia

tukahduttamalla glukoosin siirtyminen soluun,
glukoneogeneesin stimulointi - lisätä pyruvaatti-karboksylaasin, fosfoenolipyruvaattikarboksykinaasin, fruktoosi-1,6-difosfataasin entsyymien synteesiä.

Taulukossa esitetään yhteenveto hormonaalisten vaikutusten tärkeimmistä näkökohdista:

Glykolyolyysin aktivoituminen maksassa;
Glukoneogeneesin stimulointi;

Lisääntynyt glukoneogeneesi;
Vähentynyt kalvon läpäisevyys glukoosille.

Verensokeri kliinisessä käytännössä

Yli 90% kaikista liukoisista pienimolekyylipainoisista veren hiilihydraateista on glukoosia; lisäksi fruktoosi, maltoosi, mannoosi ja pentoosi voivat olla läsnä pieninä määrinä ja patologian tapauksessa galaktoosi. Yhdessä niiden kanssa veressä on proteiineihin liittyviä polysakkarideja.

Erityisesti voimakkaasti glukoosia kulutetaan ja käytetään erilaisiin keskushermoston kudoksen, punasolujen, munuaisveren tarpeisiin. Väliaineenvaihdunnassa glukoosia käytetään muodostamaan glykogeeniä, glyserolia ja rasvahappoja, aminohappoja, glukuronihappoa ja glykoproteiineja. Glukoosipitoisuus veressä on trikarboksyylihappojen glykolyysin ja hapettumisen johdannainen TCA-syklin aikana, glykogeneesi ja glykogenolyysit maksassa ja lihaskudoksessa, glukoneogeneesi maksassa ja munuaisissa sekä glukoosin saanti suolesta.

Kliinisessä käytännössä veren glukoosipitoisuuksia tutkitaan yleensä, muiden sokereiden ja glykogeenin pitoisuutta käytetään paljon harvemmin. Ihmisen veressä glukoosi jakautuu melko tasaisesti plasman ja muodostuneiden elementtien välillä, on todettu, että laskimoveren sokeripitoisuus on 0,25-1,0 mmol / l (keskimäärin 10%) vähemmän kuin valtimo- ja kapillaarivereissä. Maitohappo- ja pyruvihappojen määrittely, useiden hiilihydraattiaineenvaihdunta-entsyymien, sialic- ja heksuronihappojen, seromukoidien, glykosyloidun hemoglobiinin ja muiden indikaattoreiden aktiivisuus on tunnettu diagnostinen arvo.

Virtsan glukoosipitoisuus riippuu sen pitoisuudesta veressä, vaikka se erittyy sekä normaaliin että kohonneeseen verensokeritasoon. Kun veren glukoosipitoisuus kasvaa, niin ns. Munuaisraja ylittyy (terveillä ihmisillä se on alueella 8,3–9,9 mmol / l) ja glukosuria esiintyy. Kun arterioskleroottinen munuainen, diabetes, kynnys nousee ja glukosuriaa ei havaita, vaikka glukoosipitoisuus kasvaisi 11,0-12,1 mmol / l: iin.

Menetelmät verensokerin määrittämiseksi

Menetelmät verensokerin määrittämiseksi jaetaan kolmeen ryhmään: pelkistys, kolorimetrinen ja entsymaattinen.

Vähentämismenetelmät (On syytä muistaa, että tämän ryhmän menetelmät antavat yliarvioituja tuloksia (noin 20-25%), koska veri sisältää useita yhdisteitä, jotka eivät liity hiilihydraatteihin, mutta joilla on pelkistäviä ominaisuuksia (virtsahappo, glutationi, kreatiniini, askorbiini) happo)):
- Hagedorn-Jensenin titrometrinen menetelmä perustuu sokerin ominai- suuteen palauttaa, kun keitetään alkalisessa väliaineessa, rauta-sini ja rauta-sludinaatti kaliumsuolat. Tämän talteenoton asteen mukaan sokerin pitoisuutta veressä tutkitaan titrometrisesti. Menetelmän tärkeä etu on sen alhainen hinta ja mahdollisuus käyttää sitä missä tahansa laboratoriossa;
- perustuu nitrobenseenien pelkistykseen, esimerkiksi pikriinihappoon pikramihappoon;
- menetelmä, joka perustuu glukoosin kykyyn vähentää kuparisuoloja. Saatu monovalenttinen kupari toimii välituotteena. Ilman hapella hapetettu, se palauttaa arseeni-molybdeenihapon tai fosforotungstiinihapon, joka toimii lopullisena kromogeeninä.
Kolorimetriset menetelmät. Näitä ovat:
- Somodzhi-menetelmä - kuparin ortronireagenssin koostumuksessa olevan kuparin pelkistysreaktio kuparioksidiin. Menetelmä on työlästä, monivaiheista, ei-spesifistä eikä käytännössä käytetä tällä hetkellä;
- Folin-Wu-menetelmä - kuparin tartraatin pelkistäminen litiumoksidiksi. Menetelmä on yksinkertainen, haittapuolena on se, että saadun värin intensiteetin ja glukoosipitoisuuden välillä ei ole tiukkaa suhteellisuutta;
- glukoosipitoisuuden määrittäminen Morrisin ja Roen mukaan - glukoosin dehydraatio rikkihapon vaikutuksesta ja sen muuntuminen oksimetyylifurfuraaliksi, joka tiivistyy arthroniin siniseksi yhdisteeksi. Vaatii puhtainta reagensseja ja tiukasti pysyvän reaktiolämpötilan;
- Gultmanin orthotoluidiinimenetelmä Khivarinen-Nikkilin modifioinnissa, joka koostuu liuoksen värjäytymisen voimakkuuden määrittämisestä, joka tapahtuu, kun aromaattinen amiini ortotolidiini vuorovaikutuksessa glukoosin aldehydiryhmän kanssa happamassa väliaineessa. Tämä menetelmä on tarkka ja mahdollistaa tarkemman glukoosimäärityksen.
- Aniliinimenetelmä säilyttää ortotolueenidimenetelmän herkkyyden, mutta on vielä tarkempi.
Entsymaattiset menetelmät:
- perustuu heksokinaasireaktioon. Heksokinaasin vaikutuksen alainen glukoosi fosforyloidaan ATP: llä, tuloksena oleva Gl-6-F dehydrogenaasin läsnä ollessa palauttaa NADP: n. Jälkimmäisen määrä määräytyy valon imeytymisen lisääntyessä ultraviolettialueella. Menetelmä on liian kallista käytännön laboratorioille.
- perustuu glukoosin hapettumiseen glukuronihappoon käyttäen glukoosioksidaasin entsyymiä ja muodostumista vetyperoksidin reaktion aikana, joka (eri versioissa):
  - määritetään kemiallisilla keinoilla;
  - peroksidaasin mukana ollessa se hapettaa värittömän ortotolidiinin, muuttamalla sen vihreän sinisen väriseksi yhdisteeksi, värin riippuvuuden suoruus glukoosipitoisuudelle säilyy alueella 1,1 - 22 mmol / l;
  - fenolin läsnä ollessa osallistumalla peroksidaasiin, hapettaa 4-aminoantipyriini värilliseksi väriltään värilliseksi yhdisteeksi;
  - kupari-ionien läsnä ollessa se hapettaa fenolftaliinia fenolftaleiiniksi, joka värjätään punaisena emäksisissä olosuhteissa.
Sähkökemialliset menetelmät, joissa käytetään immobilisoituja entsyymejä sisältäviä elektrodeja, erityisesti glukoosioksidaasia. Reaktio tallennetaan muodostuneen vetyperoksidin määrällä tai glukoosin hapettamiseksi kulutetun hapen menetyksellä.
Diagnostiset nauhat, joissa käytetään glukoosioksidaasi-peroksidaasireaktiota ja bentsidiinijohdannaisia kromogeeninä.

Kolme menetelmää hyväksyttiin yhtenäisenä: Haggedorn-Jensen-titrometrinen menetelmä, orto-toluidiinimenetelmä ja o-tolidiini-glukoosioksidaasimenetelmä.

Glukoosin määrittäminen ortotolueenidimenetelmällä

periaate

Glukoosi, kun sitä kuumennetaan orthotoludilla rikkihapon läsnä ollessa, antaa sinivihreän värin.